Passage TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen-lijnen met trypsine

Summary

In deze video laten we zien hoe onze lab routinematig TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen passages met trypsine.

Abstract

In deze video laten we zien hoe onze lab routinematig TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen passages met trypsine. Menselijke embryonale stamcellen zijn artefacten van celkweek, en hebben de neiging om karyotypic afwijkingen te verwerven met een hoge populatie verdubbelingen. De juiste passage is essentieel voor het behoud van een gezonde, ongedifferentieerde, karyotypisch normale TINTEN menselijke embryonale stamcellen cultuur. Eerste, een groeiende cultuur wordt gewassen in PBS om de resterende media en celresten te verwijderen, dan cellen bedekt met een minimaal volume van warme 0,05% trypsine-EDTA. Trypsine is links op de cellen voor maximaal vijf minuten, dan cellen voorzichtig losgemaakt met een 2 ml serological pipet. De celsuspensie wordt verzameld en gemengd met een groot volume van tinten media, dan cellen zijn verzameld door zacht centrifugeren. Het geïnactiveerde trypsine media mengsel wordt verwijderd, en cellen opnieuw gesuspendeerd in voorverwarmde TINTEN media. Een passende verdeling ratio wordt berekend (over het algemeen 1u10-01u20), en cellen opnieuw uitgeplaat op een 1-2 dagen oude plaat met een monolaag van bestraalde muis embryonale fibroblasten feeder-cellen. De nieuw geplaatste TINTEN cultuur plaat is laat men het gedurende 48 uur, dan is de media wordt elke dag daarna. Het is belangrijk om niet naar beneden trpsinize tot een enkele celsuspensie, want dit verhoogt het risico van de invoering van karyotypic afwijkingen.

Protocol

Algemeen We raden aan het ontdooien niet meer dan een monster op een gegeven moment om eenvoudige bediening zorgen. De handler moet ervoor zorgen niet te laten culturen op kamertemperatuur en een lage CO2 voor langere tijd. Alle centrifugeren van levende cellen gebeurt op 500 tot 600 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. MEF (muis embryonale cellen Feeder) Pre-warm MEF media tot 37 ° C. Verwijder de MEF flacon van -80 ° C en onmiddellijk onder w…

Discussion

In deze video zien we hoe we routinematig passage TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen in ons laboratorium. Efficiënte en regelmatige splitsen en passage is essentieel voor het behoud van een gezonde menselijke embryonale stamcellen lijn. Trypsine gemedieerde passage is een belangrijk voordeel van tinten cellijnen, is het echter belangrijk om niet meer dan trypsinize culturen of om een ​​groot deel van de afzonderlijke cellen tijdens de re-platting hebben.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 ml GlutaMAXTM 6.5 ml NEAA 6.5 ml 2‐mercaptoethanol 0.5ul KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 ml bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml