الألياف الضوئية للزراعة تحفيز Optogenetic المزمن من أنسجة المخ
Summary
تطوير optogenetics يوفر الآن وسيلة لتحفيز الخلايا العصبية بدقة تعريف وراثيا ودوائر، سواء<em> في المختبر</em> و<em> في الجسم الحي</em>. نحن هنا وصف للجمعية وزرع من الألياف البصرية لضوئي مزمن في أنسجة المخ.
Abstract
وكانت أنماط توضيح من اتصالات الخلايا العصبية تحديا لعلم الأعصاب على حد سواء الأساسية والسريرية. وكان معيار الذهب الكهربية لتحليل أنماط الاتصال متشابك، ولكن التسجيلات الكهربية يمكن أن تكون مقترنة مرهقة والحد تجريبيا. وقد أدخلت تطوير optogenetics طريقة لتحفيز الخلايا العصبية أنيقة ودوائر، سواء في المختبر 1 و 2،3 في الجسم الحي. من خلال استغلال خلية من نوع النشاط المروج محددة لدفع السكان في التعبير أوبسين العصبية منفصلة، يمكن للمرء أن تحفز الخلايا العصبية بدقة فرعية محددة وراثيا في دوائر متميزة 4-6. الأساليب المذكورة لتحفيز الخلايا العصبية بشكل جيد، بما في ذلك التحفيز الكهربائي و / أو التلاعب الدوائية، وغالبا ما تكون الخلايا من نوع العشوائي، الغازية، ويمكن أن تلحق الضرر الأنسجة المحيطة بها. يمكن تغيير وظيفة هذه القيود متشابك العادية و / أو السلوك الدائرة. وبالإضافة إلى ذلك، ويرجع ذلكلطبيعة التلاعب، والأساليب المتبعة حاليا في كثير من الأحيان حادة والمحطة الطرفية. Optogenetics يتيح القدرة على تحفيز الخلايا العصبية بطريقة غير ضارة نسبيا، وتستهدف في الخلايا العصبية وراثيا. معظم الدراسات التي تنطوي على استخدام الجسم الحي في optogenetics حاليا الألياف البصرية من خلال الاسترشاد قنية مزروع 6،7، ولكن القيود المفروضة على هذه الطريقة تشمل تلف أنسجة المخ مع تكرار الإدراج من الألياف البصرية، والكسر المحتمل للألياف داخل قنية. نظرا لحقل يزدهر optogenetics، وهي طريقة أكثر موثوقية من التحفيز المزمن هو ضروري لتسهيل الدراسات طويلة الأجل مع الحد الأدنى من ضمانات تلف الأنسجة. هنا نقدم بروتوكول لدينا تعديل في مادة الفيديو لاستكمال أسلوب فعال وأنيق وصفها في سبارتا وآخرون 8 لتصنيع الألياف البصرية على زرع وتثبيت الدائم على الجمجمة من الفئران تخدير، وكذلك جمعية ليفمقرنة البصرية يربط زرع لمصدر الضوء. عملية الزرع، مرتبطة مع الألياف البصرية إلى ليزر الحالة الصلبة، ويسمح لوسيلة فعالة لphotostimulate مزمنة الدوائر العصبية الوظيفية مع أقل تلف الأنسجة 9 باستخدام، للانفصال الصغيرة، الحبال. تثبيت الدائم للزراعة وتوفر الألياف البصرية متسقة، على المدى الطويل في الدراسات المجراة optogenetic الدوائر العصبية في الفئران، مستيقظا يتصرف 10 مع الحد الأدنى من تلف الأنسجة.
Protocol
Discussion
Optogenetics هي تقنية جديدة تسمح قوية غير مسبوقة خلال مراقبة الخلايا العصبية فرعية محددة. يمكن استغلال هذا لتعديل الدوائر العصبية التشريحية بدقة والزمنية، مع تجنب العشوائية من نوع الخلية والآثار الغازية من خلال التحفيز الكهربائي الكهربائي. غرس الألياف البصرية يسمح للتح?…
Acknowledgements
نود أن نعترف بأن وصفت أصلا هذه التقنية من قبل سبارتا وآخرون، 2012 و قد تم تكييفه بسهولة لاستخدامها في المختبر.
Materials
| Name of the Reagent or Equipment | Company | Catalogue # | Comments |
| LC Ferrule Sleeve | Precision Fiber Products (PFP) | SM-CS125S | 1.25 mm ID |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| Miller FOPD-LC Disc | PFP | M1-80754 | For LC ferrules |
| Furcation tubing | PFP | FF9-250 | 900 μm o.d., 250 μm i.d. |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-1270 | 127 μm ID Bore |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-2300 | 230 μm ID Bore |
| Heat-curable epoxy, hardener and resin | PFP | ET-353ND-16OZ | |
| FC/PC and SC/PC Connector Polishing Disk | ThorLabs | D50-FC | For FC ferrules |
| Digital optical power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | Spectrophotometer |
| Polishing Pad | ThorLabs | NRS913 | 9″ x 13″ 50 Durometer |
| Aluminum oxide Lapping (Polishing) Sheets: 0.3, 1, 3, 5 μm grits | ThorLabs | LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P | |
| Standard Hard Cladding Multimode Fiber | ThorLabs | BFL37-200 | Low OH, 200 μm Core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | ThorLabs | T10S13 | Clad/Coat: 200 μm / 300 μm |
| SILICA/SILICA Optical Fiber | Polymicro Technologies | FVP100110125 | High -OH, UV Enhanced, 0.22 NA |
| 1×1 Fiberoptic Rotary Joint | doric lenses | FRJ_FC-FC | |
| Mono Fiberoptic Patchcord | doric lenses | MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC | |
| Heat shrink tubing, 1/8 inch | Allied Electronics | 689-0267 | |
| Heat gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 W; 750-800 °F |
| Cotton tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| VetBond tissue adhesive | Fischer Scientific | 19-027136 | |
| Flash denture base acrylic | Yates Motloid | ColdPourPowder+Liq | |
| BONN Miniature Iris Scissors | Integra Miltex | 18-1392 | 3-1/2″(8.9cm), straight, 15 mm blades |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Integra Miltex | 7-290 | 1-1/2″(3.8 cm), curved |
| MEGA-Torque Electric Lab Motor | Vector | EL-S | |
| Panther Burs-Ball #1 | Clarkson Laboratory | 77.1006 | |
| Violet Blue Laser System | CrystaLaser | CK473-050-O | Wavelength: 473 nm |
| Laser Power Supply | CrystaLaser | CL-2005 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | |
| 5″Straight Hemostat | Excelta | 35-PH | |
| Vise with weighted base | Altex Electronics | PAN381 |
References
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Arenkiel, B. R. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 (2007).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 165-16 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
- Zhang, F. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450, 420-424 (2007).
- Sparta, D. R. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).
- Stuber, G. D. Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking. Nature. 475, 377-380 (2011).
- Liu, X. Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature. 484, 381-385 (2012).
