장기 성인 마우스 SSC 라인의 유도를위한 문화 Spermatogonial 줄기 및 전구 세포의 일련 농축 (SSCs)
Summary
성인 마우스에서 spermatogonial 줄기 및 전구 세포 라인을 도출하고 유지하는 간단한 방법은 여기 제공됩니다. 방법은 성인 마우스 testis의 체세포 구획에서 발생하는 피더 세포를 활용합니다. 이 기술은 유전자 변형, 노크 – 아웃 등의 일반적인 마우스 변종에 적용하고, 똑 -의 생쥐.
Abstract
Spermatogonial 줄기와 testis의 전구 세포는 (SSCs) 성인 포유류의 줄기 세포의 고전적인 예를 나타냅니다과 동물의 거의 평생 불임을 보존 할 수 있습니다. 생체에 자기 갱신과 차별화에 적용되는 정확한 메커니즘은 연구에 도전하고 있지만, 다양한 시스템은 전문 문화 미디어 및 1-3 피더 세포의 조합을 사용하여 체외에서 손쥐 SSCs를 전파하는 이전에 개발되었습니다.
SSCs의 생물에 체외 forays의 대부분은 성인 세포 라인에게 4 취득의 어려움으로 인해 neonates에서 세포 라인을 도출했습니다. 그러나, testis는 대부분의 마우스 변종에 세 ~ 5 주가 지나야까지 성숙을 계속하고 있습니다. 초 후 산후 시대에는 극적인 변화가 testis의 아키텍처와 체세포와 많은 줄기 세포 관련의 표현 수준의 변경 등의 spermatogenic 세포, 모두의 생물학에서 발생유전자. 따라서 neonatally – 파생 SSC 라인이 완전히 성인 testis가 정상 상태에 도달 한 후 계속 성인 SSCs의 생물학을 요점을 되풀이하지 않을 수 있습니다.
여러 가지 요인이 역사적으로 성인 SSC 라인의 생산을 방해하고 있습니다. 첫째, 기능 줄기 세포의 비율은 고유 또는 외부 요인으로 인해 5,6하거나, 성인기 동안 감소 할 수 있습니다. 또한, 다른 성인의 줄기 세포와 마찬가지로, 그것은 immunoselection 또는 다른 정렬 전략 7의 조합을 사용하지 않고 전체 성인 고환 세포에서 충분히 SSCs을 풍요롭게하기 어려운되었습니다. 일반적으로 고용 전략은 다른 세포 유형 8 줄기 세포의 높은 비율로 인해 공여 세포의 원천으로 cryptorchid 마우스의 사용을 포함합니다. 초기 문화의 체세포 세포의 제거는 SSC의 생존에 필수적인 줄기 세포 틈새와의 상호 작용을 방해하는 가설을 바탕으로, 우리는 이전에 성인 리터를 추출하는 방법을 개발immunoselection 또는 cryptorchid 기증자를 필요로하지만, 오히려 문화에 SSCs의 일련 농축을 채용하지 않는 아이 네스는 SESC 2,3로 이하라고.
아래에서 설명하는 방법은 고환 stromal 세포 라인 (JK1) 3으로 구성 피더에 대한 세포의 도금에 이어 성인 기증자 정액을 운반하는 tubules를 dissociating하여 성인 SSC 라인을 파생하는 간단한 절차를 수반. 시리얼을 통해 비 배아 세포를 오염, 강하게 자기편, passaging 것은 SSCs의 수반하는 농축과 문화의 고갈됩니다. 이러한 방식으로 생산 문화는 장기적으로 자기 갱신 능력에 따라 SSCs를 포함하는 차별화의 다른 단계에서 spermatogonia의 혼합물을 포함합니다. SESC 방법의 요점은 그것이 근본적으로 다른 microenvironment의 체외에서 장기간 자기 갱신에 생체의 자기 갱신의 어려운 전환을 할 SSCs 수 있다는 것입니다, 오염 무료, 장기 SSC 라인을 생산체세포의 세포, 그리고이를 SSCs의 후속 실험 조작을 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
성인 testis-파생 피더 세포를 사용하여 성인 SSCs를 파생를위한이 방법은 강력한이며, 일반적인 유전 적 배경 (예 : FVB, C57Bl6 및 혼합 129SV/C57Bl/6)과 다른 돌연변이 변종이 2,3,7,14을 고용했을 때 성공했습니다. 7 사실, 문화 시스템에 의해 생성 된 microenvironment는 생체에 성인 SSCs를 (- – / 동물 plzf의 경우 등) 유지에 유전 장벽의 일부를 극복하기에 충분합니다…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강의 뉴욕 국무부 (C026878)에 의해 지원되었다. MS는 뉴욕 줄기 세포 재단 – Druckenmiller 연구원이었다. 천 재단의 3 월부터 연구 기금 5 호 – FY11-571의 일부를 지원.
Materials
| Name of Reagent/ Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-051-CI | |
| Stem cell base medium (StemPro-34) | Life Technologies | 10639-011 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| Stem cell medium supplements | various | see Table 3 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| JK1 cells | Cell Biolabs, Inc. | CBA-315 | Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007) |
| mitomycin-C (CAUTION) | Sigma-Aldrich | M4287 | Toxic; Handle with care. |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | 0.4% solution in water |
| EVOS xl digital inverted microscope | Advanced Microscopy Group | – | |
| Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3 |
|||
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| trypsin (1:250) | Life Technologies | 27250-018 | Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol |
| collagenase, type I, 235 U/ml | Worthington | CLS1 235 | Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DN25 | Dissociation buffer: Final 80 U/ml |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE-100g | Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol |
| Table 2. Dissociation buffer | |||
| StemPro-34 SFM | Life Technologies | 10639-011 | |
| StemPro-34 Nutrient supplement | Life Technologies | 10639-011 | |
| Additional supplements** | |||
| Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | 1X |
| MEM Vitamin solution | Life Technologies | 11120-052 | 1X |
| L-glutamine | Mediatech | 25-005 | 2 mM |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE | 0.50% |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Mediatech | 30-004-CI | 1X |
| D(+)glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | 6 mg/ml |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | 30 ng/ml |
| progesterone | Calbiochem | 5341 | 60 ng/ml |
| fetal bovine serum | variable | n/a | 1% |
| bovine holo-transferrin | Sigma-Aldrich | T1283 | 100 μg/ml |
| insulin | Gemini Bio-Products | 700-112P | 25 μg/ml |
| human GDNF | Life Technologies | PHC7041 | 10 ng/ml |
| human bFGF | Life Technologies | PHG0023 | 10 ng/ml |
| mouse EGF | Life Technologies | PHG0313 | 20 ng/ml |
| putrescine | Research Organics | 0778P | 60 μM |
| sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| pyruvic acid | Alfa Aesar | A13875 | 30 μg/ml |
| DL-lactic acid | J.T. Baker | 0196-04 | 1 μg/ml |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 50 μM |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | 100 μM |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 μg/ml |
| Table 3. Stem cell medium | |||
| *Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks. | |||
| **We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed. |
Referências
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