Seriel Berigelse af spermatogonstamceller Stem og progenitorceller (SSCs) i Kultur for Udledning af Langsigtede voksen mus SSC Lines

Summary

En simpel metode til udledning og opretholde spermatogonier stamceller og stamcelle linier fra voksne mus er vist her. Fremgangsmåden anvender fødeceller stammer fra somatiske celler rum i den voksne mus testis. Denne teknik kan anvendes til almindelige musestammer, herunder transgene, knock-out, og banke-i mus.

Abstract

Spermatogonier stamceller og progenitorceller (SSCs) af testis repræsenterer et klassisk eksempel på voksne mammale stamceller og bevare fertiliteten for næsten hele dyrets levetid. Mens de præcise mekanismer, der styrer selvfornyelse og differentiering in vivo er udfordrende at undersøgelsen har forskellige systemer blevet udviklet tidligere at udbrede murine SSCs in vitro ved hjælp af en kombination af specialiserede dyrkningsmedier og fødeceller ^1-3.

De fleste in vitro strejftog i biologi SSCs er afledt cellelinier fra nyfødte, muligvis på grund af vanskelighederne med at få voksne cellelinier ^4. Imidlertid testis fortsætter med at modne, indtil ~ 5 uger gamle i de fleste musestammer. I den tidlige post-natale periode, forekommer dramatiske ændringer i arkitekturen af ​​testiklerne og i biologi både somatiske og spermatogene celler, herunder ændringer i ekspressionsniveauer af adskillige stamcelle-relateredegener. Derfor kan neonatally-afledte SSC linier ikke fuldt rekapitulere biologi voksne SSCs, der resterer, efter at voksen testikel har nået en stabil tilstand.

Flere faktorer har forhindret produktionen af ​​voksne SSC linjer historisk. For det første kan andelen af funktionelle stamceller falde i voksenalderen, enten på grund af indre eller ydre faktorer ^5,6. Som med andre voksne stamceller, har det været vanskeligt at berige SSCs tilstrækkeligt fra samlede voksne testikulære celler uden anvendelse af en kombination af immunselektion eller andre sortering strategier ^7. Almindeligt anvendte strategier indbefatter anvendelsen af kryptorkide mus som en kilde til donorceller som følge af et højere forhold mellem stamceller til andre celletyper ^8. Baseret på den hypotese, at fjernelsen af ​​somatiske celler fra den oprindelige kultur forstyrrer interaktioner med stamceller niche, som er afgørende for SSC overlevelse, vi tidligere udviklet metoder til at udlede voksen lines, der ikke kræver immunselektion eller kryptorkide donorer, men snarere ansætte seriel berigelse af SSCs i kultur, i det følgende benævnt SESC ^2,3.

Den nedenfor beskrevne metode indebærer en enkel procedure til at aflede voksne SSC linier ved at dissociere voksen donor sædkanalerne, efterfulgt af udpladning af celler på fødere bestående af en testikel stromacelle line (JK1) ^3. Gennem seriel passage, stærkt klæbende, kontaminerende non-kønsceller er opbrugt fra kulturen med samtidig berigelse af SSCs. Kulturer er fremstillet på denne måde indeholder en blanding af spermatogonier på forskellige stadier af differentiering, som indeholder SSCs, baseret på langsigtet selvfornyelsespotentiale formåen. Det centrale i SESC metode er, at det gør det muligt SSCs at gøre den vanskelige overgang fra selvfornyelse in vivo til langsigtet selvfornyelse in vitro i en radikalt anderledes mikromiljø, producerer langsigtede SSC linjer, fri for kontaminerendesomatiske celler, og hvorved efterfølgende eksperimentel manipulation af SSCs.

Protocol

1. Fremstilling af fødeceller Bemærk, at alle reagenser er beskrevet nedenfor bør udarbejdes i steril måde (se tabel 1 og 2). Denne protokol anvender JK1 cellelinie (Cell Biolabs, Inc., katalog # CBA-315) som fødere, som er en transformeret derivat af voksne mus testikulære somatiske celler og er blevet beskrevet andetsteds 3. Bemærk også, at alle dyreforsøg skal udføres i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier og regler. <…

Representative Results

Fremkomsten af passagen nul vildtype, er voksne SSC kolonier efter 7 dage i figur 1 viste. Tredimensionale kolonier består af et lag af flade celler knyttet til foderautomater eller slave ekstracellulær matrix deponeret af føderne med flere lag af SSCs vokser på toppen. Mens sunde SSCs er klart refraktile og ensartet 11-12 um diameter, cellekanterne er vanskelige at adskille og størrelsen af ​​kolonierne kan være meget variabel, både inden i brønden og mellem brønde fremstillet ud fra forsk…

Discussion

Denne metode til at udlede voksne SSCs på voksne testis-afledte fødeceller er robust og det er lykkedes, når de fælles genetiske baggrunde (f.eks FVB, C57BL6 og blandet 129SV/C57Bl/6) og forskellige mutantstammer var ansat ^2,3,7,14. Faktisk er mikromiljøet skabt af dyrkningssystemet tilstrækkeligt til at overvinde nogle af de genetiske barrierer for at opretholde voksne SSCs in vivo (fx i tilfælde af plzf ^{– / –} dyr) ^7. Mens vi beskæftiger JK1 celler som fødere,…

Materials

Name of Reagent/ Material	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
Trypsin/EDTA	Mediatech	25-051-CI
Stem cell base medium (StemPro-34)	Life Technologies	10639-011	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
Stem cell medium supplements	various	see Table 3	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
JK1 cells	Cell Biolabs, Inc.	CBA-315	Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007)
mitomycin-C (CAUTION)	Sigma-Aldrich	M4287	Toxic; Handle with care.
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890	0.4% solution in water
EVOS xl digital inverted microscope	Advanced Microscopy Group	–
			Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
trypsin (1:250)	Life Technologies	27250-018	Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol
collagenase, type I, 235 U/ml	Worthington	CLS1 235	Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol
DNAse I	Sigma-Aldrich	DN25	Dissociation buffer: Final 80 U/ml
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE-100g	Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol
			Table 2. Dissociation buffer
StemPro-34 SFM	Life Technologies	10639-011
StemPro-34 Nutrient supplement	Life Technologies	10639-011
Additional supplements**
Non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145	1X
MEM Vitamin solution	Life Technologies	11120-052	1X
L-glutamine	Mediatech	25-005	2 mM
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE	0.50%
Antibiotic-Antimycotic Solution	Mediatech	30-004-CI	1X
D(+)glucose	Sigma-Aldrich	G8769	6 mg/ml
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	30 ng/ml
progesterone	Calbiochem	5341	60 ng/ml
fetal bovine serum	variable	n/a	1%
bovine holo-transferrin	Sigma-Aldrich	T1283	100 μg/ml
insulin	Gemini Bio-Products	700-112P	25 μg/ml
human GDNF	Life Technologies	PHC7041	10 ng/ml
human bFGF	Life Technologies	PHG0023	10 ng/ml
mouse EGF	Life Technologies	PHG0313	20 ng/ml
putrescine	Research Organics	0778P	60 μM
sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261	30 nM
pyruvic acid	Alfa Aesar	A13875	30 μg/ml
DL-lactic acid	J.T. Baker	0196-04	1 μg/ml
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023	50 μM
ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544	100 μM
D-biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 μg/ml
			Table 3. Stem cell medium
			*Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks.
			**We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed.