Seriële Verrijking van spermatogonia stam-en progenitorcellen (SSC's) in cultuur voor het afleiden van lange termijn Adult Mouse SSC Lines

Summary

Een eenvoudige methode voor het afleiden van en onderhouden van SSC en stamceltransplantatie lijnen van volwassen muizen wordt hier gepresenteerd. De werkwijze gebruikt voedingscellen afkomstig van de somatische cel compartiment van de volwassen muis testis. Deze techniek is voor het gemeenschappelijk muizenstammen, inclusief transgene, knock-out en knock-in muizen.

Abstract

SSC en progenitorcellen (SSC) van de testis zijn een klassiek voorbeeld van volwassen zoogdier stamcellen en behouden vruchtbaarheid bijna de levensduur van het dier. Hoewel de precieze mechanismen die zelfvernieuwing en differentiatie regeren in vivo zijn uitdagend om te studeren, zijn er verschillende systemen zijn eerder ontwikkeld voor muriene SSC's in vitro met behulp van een combinatie van gespecialiseerde cultuurmedia en feeder cellen ^{1 tot 3} propageren.

De meeste in vitro uitstapjes naar de biologie van SSCs zijn afgeleide cellijnen van pasgeborenen, mogelijk vanwege de moeilijkheid om volwassen cellijnen ^4. De testis verder te rijpen tot ~ 5 weken oud in de meeste muizenstammen. In de vroege postnatale periode dramatische veranderingen in de architectuur van de testis en de biologie van zowel somatische cellen en spermatogenese, met inbegrip van wijzigingen in expressieniveaus van tal stamcel-gerelateerdegenen. Daarom kan neonataal afgeleide SSC lijnen niet volledig herhalen de biologie van volwassen SSC's die blijven bestaan ​​na de volwassen testis heeft bereikt een steady state.

Verschillende factoren hebben gehinderd de productie van volwassen SSC lijnen historisch. Ten eerste kan de verhouding van functionele stamcellen afnemen in volwassenheid, hetzij door intrinsieke of extrinsieke factoren ^5,6. Zoals met andere volwassen stamcellen, was het moeilijk voldoende verrijking van SSCs totale volwassen zaadcellen zonder een combinatie van immunoselectie of sorteren strategieën ^7. Gewoonlijk toegepast omvatten het gebruik van cryptorchide muizen als bron van donor cellen door een hogere verhouding van stamcellen om andere celtypen ^8. Gebaseerd op de hypothese dat de verwijdering van somatische cellen van het oorspronkelijke kweek interacties met de stamcellen niche die essentieel zijn voor overleving SSC verstoort, we eerder ontwikkelde methoden voor het afleiden volwassen lines die geen immunoselectie of cryptorchide donoren, maar eerder in dienst seriële verrijking van SSC's in de cultuur, hierna te noemen SESC ^2,3.

De hieronder beschreven methode brengt een eenvoudige procedure voor het afleiden van volwassen SSC lijnen door dissociëren volwassen donor testes, gevolgd door platen van cellen op feeders bestaat uit een testiculaire stromale cellijn (JK1) ^3. Door middel van seriële passage, sterk hechtende, niet-vervuilende kiemcellen worden uitgeput uit de cultuur met bijkomende verrijking van SSC's. Culturen die op deze wijze een mengsel van spermatogonia in verschillende stadia van differentiatie, die bevatten SSCs, gebaseerd op lange termijn zelfvernieuwing vermogen. De kern van de SESC methode is dat het SSC's in staat stelt om de moeilijke overgang van zelf-vernieuwing in vivo te maken op de lange termijn zelfvernieuwing in vitro in een radicaal andere micro-omgeving, produceert lange termijn SSC lijnen, vrij van verontreinigendesomatische cellen, en op basis waarvan daaropvolgende experimentele manipulatie van SSC.

Protocol

1. Bereiding van voedingscellen Merk op dat alle reagentia hieronder beschreven worden bereid in steriele wijze (zie tabellen 1 en 2). Dit protocol maakt gebruik van de JK1 cellijn (Cell Biolabs, Inc, catalogus # CBA-315) als feeders die een getransformeerde afgeleide van volwassen muis testiculaire somatische cellen en elders is 3 beschreven. Merk ook op dat alle dierlijke procedures moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele…

Representative Results

Het uiterlijk van passage nul wild type, een volwassene SSC kolonies na 7 dagen figuur 1. Driedimensionale kolonies bestaan ​​uit een laag van platte cellen aan de stroomvoorziening of ondergeschikte extracellulaire matrix afgezet door de feeders met meerdere lagen SSCs groeien geplaatst. Terwijl gezonde SSCs zijn licht en uniform refractiele 11-12 urn diameter, de celranden zijn moeilijk te onderscheiden en de grootte van de kolonies kunnen zeer variabel, zowel binnen de put en tussen wells bereid …

Discussion

Deze methode voor het afleiden van volwassen SSC's met volwassen testis afgeleide feeder-cellen is robuust en is erin geslaagd om als gemeenschappelijke genetische achtergronden (bv. FVB, C57Bl6 en gemengde 129SV/C57Bl/6) en verschillende mutante stammen werden gebruikt ^2,3,7,14. In feite is de micro die door het cultuurstelsel voldoende is om een deel van de genetische belemmeringen handhaven volwassen SSC in vivo (bijvoorbeeld bij plzf ^{– / –} dieren) overwinnen ^7. …

Materials

Name of Reagent/ Material	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
Trypsin/EDTA	Mediatech	25-051-CI
Stem cell base medium (StemPro-34)	Life Technologies	10639-011	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
Stem cell medium supplements	various	see Table 3	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
JK1 cells	Cell Biolabs, Inc.	CBA-315	Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007)
mitomycin-C (CAUTION)	Sigma-Aldrich	M4287	Toxic; Handle with care.
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890	0.4% solution in water
EVOS xl digital inverted microscope	Advanced Microscopy Group	–
			Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
trypsin (1:250)	Life Technologies	27250-018	Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol
collagenase, type I, 235 U/ml	Worthington	CLS1 235	Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol
DNAse I	Sigma-Aldrich	DN25	Dissociation buffer: Final 80 U/ml
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE-100g	Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol
			Table 2. Dissociation buffer
StemPro-34 SFM	Life Technologies	10639-011
StemPro-34 Nutrient supplement	Life Technologies	10639-011
Additional supplements**
Non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145	1X
MEM Vitamin solution	Life Technologies	11120-052	1X
L-glutamine	Mediatech	25-005	2 mM
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE	0.50%
Antibiotic-Antimycotic Solution	Mediatech	30-004-CI	1X
D(+)glucose	Sigma-Aldrich	G8769	6 mg/ml
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	30 ng/ml
progesterone	Calbiochem	5341	60 ng/ml
fetal bovine serum	variable	n/a	1%
bovine holo-transferrin	Sigma-Aldrich	T1283	100 μg/ml
insulin	Gemini Bio-Products	700-112P	25 μg/ml
human GDNF	Life Technologies	PHC7041	10 ng/ml
human bFGF	Life Technologies	PHG0023	10 ng/ml
mouse EGF	Life Technologies	PHG0313	20 ng/ml
putrescine	Research Organics	0778P	60 μM
sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261	30 nM
pyruvic acid	Alfa Aesar	A13875	30 μg/ml
DL-lactic acid	J.T. Baker	0196-04	1 μg/ml
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023	50 μM
ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544	100 μM
D-biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 μg/ml
			Table 3. Stem cell medium
			*Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks.
			**We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed.