Serielle Anreicherung von Spermatogonien Stamm-und Progenitorzellen (SSC) in der Kultur für die Ableitung des langfristigen adulten Maus SSC Linien

Summary

Eine einfache Methode zur Ableitung und pflegen Spermatogonien Stamm-und Vorläuferzellen Zelllinien aus erwachsenen Mäusen wird hier vorgestellt. Das Verfahren nutzt Feeder-Zellen, die aus dem somatischen Zellkompartiment der adulten Maus Hoden. Diese Technik ist für die gemeinsame Mausstämmen, auch transgenen Knock-out und Knock-in Mäusen.

Abstract

Spermatogonien Stamm-und Progenitorzellen (SSC) der Hoden sind ein klassisches Beispiel für adulten Stammzellen und die Erhaltung der Fruchtbarkeit für fast die gesamte Lebensdauer des Tieres. Während die genauen Mechanismen, die Selbsterneuerung und Differenzierung in vivo zu regeln Studie sind anspruchsvoll, wurden verschiedene Systeme zuvor murinen SSCs in vitro unter Verwendung einer Kombination von speziellen Kulturmedien und Feeder-Zellen ^1-3 Propagation entwickelt.

Die meisten in vitro Streifzüge in die Biologie der SSCs haben Zelllinien von Neugeborenen, möglicherweise aufgrund der Schwierigkeiten bei der Beschaffung Erwachsenen Zelllinien ⁴ abgeleitet. Jedoch weiterhin die Hoden zu reifen bis ~ 5 Wochen alt in den meisten Mausstämmen. In den frühen postnatalen Phase treten dramatischen Veränderungen in der Architektur der Hoden und in der Biologie der sowohl somatische und spermatogenen Zellen, einschließlich Änderungen in Expression von zahlreichen Stammzellen-bezogeneGene. Daher kann abgeleitet SSC neonatal-Linien nicht vollständig rekapitulieren die Biologie von erwachsenen SSCs, die nach der erwachsenen Testis einen stationären Zustand erreicht hat persistieren.

Mehrere Faktoren haben die Produktion von Erwachsenen SSC Linien behindert historisch. Erstens kann der Anteil an funktionellen Stammzellen im Erwachsenenalter verringern, entweder durch intrinsische oder extrinsische Faktoren ^5,6. Weiterhin, wie bei anderen adulten Stammzellen, ist es schwierig gewesen, um ausreichend SSCs bereichern aus Gesamt erwachsenen Hodenzellen ohne Verwendung einer Kombination von Immunselektion oder andere Sortier Strategien ^7. Üblicherweise eingesetzten Strategien zählen die Verwendung von Mäusen kryptorchiden als Quelle von Donorzellen aufgrund einer höheren Verhältnis von Stammzellen zu anderen Zelltypen ^8. Basierend auf der Hypothese, dass die Entfernung von somatischen Zellen aus der Vorkultur Interaktionen mit der Stammzell-Nische, die für SSC Überleben stört, haben wir bisher entwickelten Methoden zur Ableitung von Erwachsenen lines die keine Immunselektion und kryptorchiden Spendern einzusetzen sondern seriellen Anreicherung von SSC in Kultur, nachfolgend als ^2,3 SESC.

Das nachfolgend beschriebene Verfahren führt zu einer einfachen Prozedur zum Ableiten erwachsenen SSC Linien durch Dissoziieren erwachsenen Spenders Samenleiter, durch Plattieren von Zellen auf einer Feeder testikulären stromalen Zelllinie (JK1) ³ umfasst gefolgt. Durch serielle Passagierung, stark haftenden, nicht-verunreinigenden Keimzellen aus der Kultur bei gleichzeitiger Anreicherung von SSCs abgereichert. Kulturen auf diese Weise hergestellte enthalten eine Mischung aus Spermatogonien in verschiedenen Stadien der Differenzierung, welche enthalten SSC, über langfristige Selbsterneuerung Fähigkeit auswählt. Der Kern des SESC Methode ist, dass SSCs ermöglicht, den schwierigen Übergang von der Selbst-Erneuerung in vivo-bis langfristigen Selbsterneuerung in vitro in einer radikal anderen Mikroumgebung zu machen, produziert langfristige SSC Linien, frei von verunreinigendensomatischen Zellen und ermöglicht dadurch anschließenden experimentellen Manipulation von SSCs.

Protocol

Ein. Vorbereitung der Feeder-Zellen Beachten Sie, dass alle Reagenzien im Folgenden beschriebenen steril vorbereitet werden (siehe Tabellen 1 und 2). Dieses Protokoll nutzt die JK1 Zelllinie (Cell Biolabs, Inc., Katalog # CBA-315) als Zubringer, die eine transformierte Derivat des erwachsenen Maus Hoden somatischen Zellen ist und wurde an anderer Stelle 3 beschrieben. Beachten Sie auch, dass alle Tierversuche im Einklang mit den institutionellen Ric…

Representative Results

Das Aussehen der Passage Null Wildtyp wird Erwachsenen SSC Kolonien nach 7 Tagen in Abbildung 1 dargestellt. Dreidimensionale Kolonien werden aus einer Schicht aus flachen Zellen, die an die Speiser oder underling extrazellulären Matrix abgeschieden durch den Abzweigen mit mehreren Schichten von SSCs wachsenden oben besteht. Während gesunde SSCs hell und gleichmäßig refractile 11-12 Mikrometer Durchmesser sind, sind die Zellgrenzen schwierig zu unterscheiden, und die Größe der Kolonien kann sehr v…

Discussion

Diese Methode zur Ableitung Erwachsenen SSCs mit adulten Hoden-derived Feeder-Zellen ist robust und gelungen, wenn gemeinsame genetische Herkunft (zB FVB, C57Bl6 und gemischte 129SV/C57Bl/6) und verschiedene Mutanten ^2,3,7,14 beschäftigt waren. In der Tat ist die Mikroumgebung von der Kultur-System angelegt ausreicht, um einige der genetischen Barrieren zur Aufrechterhaltung erwachsenen SSCs in vivo (zB im Falle von PLZF ^{– / –} Tieren) überwunden ^7. Während wir JK1 Ze…

Materials

Name of Reagent/ Material	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
Trypsin/EDTA	Mediatech	25-051-CI
Stem cell base medium (StemPro-34)	Life Technologies	10639-011	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
Stem cell medium supplements	various	see Table 3	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
JK1 cells	Cell Biolabs, Inc.	CBA-315	Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007)
mitomycin-C (CAUTION)	Sigma-Aldrich	M4287	Toxic; Handle with care.
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890	0.4% solution in water
EVOS xl digital inverted microscope	Advanced Microscopy Group	–
			Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
trypsin (1:250)	Life Technologies	27250-018	Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol
collagenase, type I, 235 U/ml	Worthington	CLS1 235	Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol
DNAse I	Sigma-Aldrich	DN25	Dissociation buffer: Final 80 U/ml
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE-100g	Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol
			Table 2. Dissociation buffer
StemPro-34 SFM	Life Technologies	10639-011
StemPro-34 Nutrient supplement	Life Technologies	10639-011
Additional supplements**
Non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145	1X
MEM Vitamin solution	Life Technologies	11120-052	1X
L-glutamine	Mediatech	25-005	2 mM
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE	0.50%
Antibiotic-Antimycotic Solution	Mediatech	30-004-CI	1X
D(+)glucose	Sigma-Aldrich	G8769	6 mg/ml
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	30 ng/ml
progesterone	Calbiochem	5341	60 ng/ml
fetal bovine serum	variable	n/a	1%
bovine holo-transferrin	Sigma-Aldrich	T1283	100 μg/ml
insulin	Gemini Bio-Products	700-112P	25 μg/ml
human GDNF	Life Technologies	PHC7041	10 ng/ml
human bFGF	Life Technologies	PHG0023	10 ng/ml
mouse EGF	Life Technologies	PHG0313	20 ng/ml
putrescine	Research Organics	0778P	60 μM
sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261	30 nM
pyruvic acid	Alfa Aesar	A13875	30 μg/ml
DL-lactic acid	J.T. Baker	0196-04	1 μg/ml
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023	50 μM
ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544	100 μM
D-biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 μg/ml
			Table 3. Stem cell medium
			*Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks.
			**We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed.