Enriquecimento de série-tronco de esperma e células progenitoras (SSC) em Cultura para Derivação de longo prazo Adultos Linhas rato SSC

Summary

Um método simples para obter e manter a haste espermatogónias e linhas de células progenitoras a partir de ratos adultos, é aqui apresentada. O método utiliza células de alimentação provenientes do compartimento de células somáticas do testículo do rato adulto. Esta técnica é aplicável a linhagens de camundongos comuns, incluindo transgênico, knock-out, e bater-nos camundongos.

Abstract

Tronco espermatogônias e as células progenitoras (SSCS) dos testículos representam um exemplo clássico de células-tronco adultas de mamíferos e preservar a fertilidade por quase toda a vida do do animal. Embora os mecanismos precisos que controlam a auto-renovação e diferenciação in vivo são difíceis de estudo, vários sistemas têm sido desenvolvidos anteriormente para propagar SSC murinos in vitro, utilizando uma combinação de meios de cultura e as células especializadas do alimentador ^1-3.

Mais em incursões in vitro sobre a biologia do SSC ter derivado de linhas celulares a partir de recém-nascidos, possivelmente devido à dificuldade na obtenção de linhas de células adultas ^4. No entanto, os testículos continua a amadurecer-se até ~ 5 semanas de idade na maioria das estirpes de ratinho. No período pós-natal precoce, mudanças drásticas ocorrem na arquitectura dos testículos e na biologia de ambos células somáticas e de espermatogénese, incluindo alterações nos níveis de expressão de células estaminais numerosos relacionadagenes. Portanto, as linhas-neonatal derivados SSC não pode inteiramente recapitular a biologia do SSC adultos que persistem após o testículo adulto chegou a um estado estacionário.

Vários fatores têm dificultado a produção de linhas de adultos SSC historicamente. Em primeiro lugar, a proporção de células-tronco funcionais pode diminuir durante a idade adulta, quer devido a factores intrínsecos ou extrínsecos ^5,6. Além disso, como com outras células-tronco adultas, tem sido difícil para enriquecer suficientemente SSC a partir de células adultas totais testiculares sem o uso de uma combinação de estratégias de triagem ou imuno outros ^7. Estratégias geralmente utilizadas incluem a utilização de ratinhos criptorquídios como uma fonte de células do doador, devido a uma maior proporção de células estaminais para outros tipos de células ^8. Com base na hipótese de que a remoção de células somáticas a partir da cultura inicial perturba as interacções com o nicho de células estaminais que são essenciais para a sobrevivência SSC, que anteriormente desenvolvidos métodos para derivar l adultoines que não necessitam de imuno ou doadores criptorquídios mas sim empregar enriquecimento série de SSC em cultura, a seguir referido como SESC ^2,3.

O método descrito a seguir envolve um procedimento simples para derivar linhas adultos SSC, dissociando adulto dador túbulos seminíferos, seguido por plaqueamento das células em alimentadores que compreendem uma linha celular de estroma testicular (JK1) ^3. Através de série passagem, fortemente aderente, contaminando germinativas células não estão esgotados a partir da cultura de enriquecimento concomitante de SSC. Culturas produzidas desta forma contém uma mistura de espermatogônias em diferentes estágios de diferenciação, as quais contêm, com base em SSC a longo prazo a capacidade auto-renovação. O cerne do método SESC é que ele permite SSC para fazer a transição difícil de auto-renovação in vivo a longo prazo de auto-renovação in vitro num microambiente radicalmente diferente, produz linhas de longo prazo do CCD, livre de contaminaçãocélulas somáticas, e desse modo permite a manipulação experimental subsequente de SSC.

Protocol

1. Preparação de células de alimentação Note-se que todos os reagentes descritos em seguida devem ser preparadas de forma estéril (ver Tabelas 1 e 2). Este protocolo utiliza a linha celular de JK1 (Cell Biolabs, Inc., catálogo # CBA-315) como alimentadores, que é um derivado de transformada de rato adulto células testiculares somáticas e foi descrito em outro lugar 3. Note-se também que todos os procedimentos com animais deve ser realizad…

Representative Results

A aparência do tipo passagem de zero selvagem, as colónias adultas SSC depois de 7 dias é mostrado na Figura 1. Tridimensionais colónias são constituídas por uma camada de células planas ligadas aos alimentadores ou matriz extracelular underling depositados pelos alimentadores com múltiplas camadas de SSC que crescem no topo. Enquanto SSC saudáveis ​​são brilhantemente refrangente e uniformemente 11-12 um de diâmetro, as bordas das células são difíceis de distinguir e o tamanho das col…

Discussion

Este método para derivar SSCs adultos utilizando células adultas derivadas de testículos de alimentação é robusto e tem êxito quando comuns origens genéticas (por exemplo, FVB, C57BL6 e 129SV/C57Bl/6 mista) e diferentes cepas mutantes foram empregados ^2,3,7,14. Na verdade, o microambiente criado pelo sistema de cultura é suficiente para superar algumas barreiras genéticas para manter SSC adultos in vivo (por exemplo, no caso de plzf ^{– / – de} animais) ^7.</su…

Materials

Name of Reagent/ Material	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
Trypsin/EDTA	Mediatech	25-051-CI
Stem cell base medium (StemPro-34)	Life Technologies	10639-011	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
Stem cell medium supplements	various	see Table 3	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
JK1 cells	Cell Biolabs, Inc.	CBA-315	Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007)
mitomycin-C (CAUTION)	Sigma-Aldrich	M4287	Toxic; Handle with care.
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890	0.4% solution in water
EVOS xl digital inverted microscope	Advanced Microscopy Group	–
			Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
trypsin (1:250)	Life Technologies	27250-018	Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol
collagenase, type I, 235 U/ml	Worthington	CLS1 235	Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol
DNAse I	Sigma-Aldrich	DN25	Dissociation buffer: Final 80 U/ml
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE-100g	Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol
			Table 2. Dissociation buffer
StemPro-34 SFM	Life Technologies	10639-011
StemPro-34 Nutrient supplement	Life Technologies	10639-011
Additional supplements**
Non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145	1X
MEM Vitamin solution	Life Technologies	11120-052	1X
L-glutamine	Mediatech	25-005	2 mM
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE	0.50%
Antibiotic-Antimycotic Solution	Mediatech	30-004-CI	1X
D(+)glucose	Sigma-Aldrich	G8769	6 mg/ml
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	30 ng/ml
progesterone	Calbiochem	5341	60 ng/ml
fetal bovine serum	variable	n/a	1%
bovine holo-transferrin	Sigma-Aldrich	T1283	100 μg/ml
insulin	Gemini Bio-Products	700-112P	25 μg/ml
human GDNF	Life Technologies	PHC7041	10 ng/ml
human bFGF	Life Technologies	PHG0023	10 ng/ml
mouse EGF	Life Technologies	PHG0313	20 ng/ml
putrescine	Research Organics	0778P	60 μM
sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261	30 nM
pyruvic acid	Alfa Aesar	A13875	30 μg/ml
DL-lactic acid	J.T. Baker	0196-04	1 μg/ml
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023	50 μM
ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544	100 μM
D-biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 μg/ml
			Table 3. Stem cell medium
			*Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks.
			**We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed.