Molécula única imagem da regulação gênica<em> Em vivo</em> Uso de ativação Cotranslational por clivagem (CoTrAC)
Summary
Descreve-se um método de fluorescência microscopia, Activation Co-translacional pela clivagem (CoTrAC), a imagem a produção de moléculas de proteína de células vivas com uma única molécula de precisão, sem perturbar a funcionalidade da proteína. Este método tem sido utilizado para seguir as dinâmicas de expressão estocásticos de um factor de transcrição, o repressor CI λ<sup> 1</sup>.
Abstract
Descreve-se um método de fluorescência microscopia, Activation Co-translacional pela clivagem (CoTrAC) a imagem a produção de moléculas de proteína de células vivas com uma única molécula de precisão, sem perturbar a funcionalidade da proteína. Este método faz com que seja possível contar o número de moléculas de proteínas produzidas em uma célula durante sequenciais, as janelas de tempo de cinco minutos. Ela requer um microscópio de fluorescência com o laser de densidade de potência de excitação de ~ 0,5-1 kW / cm 2, o que é suficientemente sensível para detectar moléculas individuais de proteínas fluorescentes em células vivas. O repórter fluorescente usada neste método consiste em três partes: uma sequência de membrana alvo, um amadurecimento rápido, proteína fluorescente amarela e uma sequência de reconhecimento de protease. O repórter é traducionalmente fundidas com o N-terminal de uma proteína de interesse. As células são cultivadas em um estágio de microscópio de temperatura controlada. De cinco em cinco minutos, moléculas fluorescentes no interior das células são criadas imagens (e mais tarde coUnted, analisando imagens de fluorescência) e, posteriormente, Foto-descoloração, de modo que apenas as proteínas recém-convertidos são contados na medição seguinte.
Imagens de fluorescência resultantes deste método podem ser analisados por detecção de manchas fluorescentes em cada imagem, atribuindo-lhes a células individuais e, em seguida, a atribuição de células de linhagens de células. O número de proteínas produzidas dentro de uma janela de tempo numa dada célula é calculado dividindo-se a intensidade de fluorescência das manchas integrada com a intensidade média de moléculas fluorescentes individuais. Foi utilizado este método para medir os níveis de expressão na gama de 0-45 moléculas individuais em janelas de tempo 5 min. Este método permitiu-nos medir o ruído na expressão do repressor λ CI, e tem muitas outras aplicações potenciais em sistemas de biologia.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método CoTrAC pode ser generalizado para medir a produção de outras proteínas em que N-ou C-terminais convencionais fusões de proteínas fluorescentes podem comprometer a actividade da proteína. A estratégia CoTrAC tem três vantagens únicas sobre os métodos correntes. Em primeiro lugar, co-traducional fusão assegura que uma molécula do repórter fluorescente é produzido para cada molécula da proteína de interesse, permitindo a contagem precisa da produção de proteína em tempo real. Em segundo lugar, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O pCG001 plasmídeo expressando Ubp1 foi gentilmente cedido por Rohan Baker na Curtin João Escola de Pesquisa Médica. Este trabalho foi financiado pela March of Dimes Bolsa de Investigação 1-FY2011, March of Dimes O'Connor Iniciado Basil Prêmio de Pesquisa Acadêmico # 5-FY20 e NSF concessão de CARREIRA 0.746.796.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
| Milli-Q H2O | |||
| 5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
| 20% glucose | |||
| MgSO4 | |||
| CaCl2 | |||
| 50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
| Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
| Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
| EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
Referências
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