高度な3D蛍光顕微鏡を用いたオートファジーの定量分析
Summary
オートファジーは、細胞がタンパク質や細胞小器官が低下し、リサイクルを可能にするユビキタスプロセスです。我々はautolysosomesに小さいが、オートファゴソームとリソソームの形成と流通を含むオートファジーの誘導に関連付けられている本質的な、物理的な変化、およびそれらの融合を可視化し、定量化するための高度な蛍光顕微鏡を適用します。
Abstract
手術はインポテンスや失禁の重大なリスクを運ぶ一方、前立腺がんは米国の男性の間で悪性腫瘍の主要な形式であり、従来の化学療法のアプローチは主に成功していない。ホルモン療法は、早期に有効であるが、多くの場合、ホルモン不応性腫瘍の最終的な開発に失敗する。我々は、腫瘍細胞の特異的な代謝不足を標的治療薬の開発に興味を持ってきた。我々は、最近、前立腺腫瘍細胞を特異的アミノ酸アルギニン1の合成に関与する酵素（アルギニノコハク酸シンターゼ、またはASS）を欠いていることを示した。この条件は、外因性アルギニンに依存するようになるために腫瘍細胞を生じ、遊離アルギニンはアルギニンデイミナーゼ（ADI）1,10でなくなった時点で、彼らは、代謝ストレスを受ける。実際、我々は、ヒト前立腺癌細胞を効果的にCWR22 Rv1のカスパーゼ非依存性アポトーシスおよび積極的なautophaでADIによって殺されていることが示されているGY（またはマクロオートファジー ）1,2,3。オートファジーは、細胞が4,5栄養飢餓時のリソソーム分解により不要なタンパク質を代謝することができます進化的に保存されたプロセスである。この経路の必須成分は、6,7,8,9十分に特徴付けられているが、分子機構の多くの側面は、まだ不明である-特に、ADI処理後の前立腺癌細胞の死応答におけるファジーの役割は何か？この問題に対処するために、我々は細胞内のオートファジー応答のレベルと範囲を測定するための実験方法を必要とし – そして、正確に、このプロセスを追跡することができます知られて分子マーカーが存在しないので、我々が使用して、イメージングベースのアプローチを開発することを選んだん定量的な3D蛍光顕微鏡11,12。
オートファゴソームとリソソームのための蛍光プローブと特異的に標識CWR22Rv1細胞を使用して、我々は3次元画像スタックがWiどちらで取得することを示すdefieldデコンボリューション顕微鏡（以降では、超解像と、構造化照明顕微鏡）が明らかにオートファジー誘導の初期段階をキャプチャすることができます。市販のデジタル画像解析アプリケーションにより、我々は容易にオートファゴソームとリソソーム数、大きさ、分布、および任意の画像化された細胞からの共局在化の程度に関する統計情報を取得することができます。この情報は、私たちは正確に生細胞におけるオートファジーの進行状況を追跡することを可能にし、癌化学療法におけるオートファジーの役割への当社の継続的な調査を可能にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
LC3に対する蛍光プローブで標識された細胞の直接観察が広くオートファジー応答6を確認するための標準的な方法として認められているが、定量的な3D同じシステムのイメージング（私たちが行ったように）、細胞オートファジーの複雑なプロセスについて前例のない情報と詳細を提供。特に、我々は、生細胞におけるオートファゴソームの数百（そうでなければ数千）オートファジ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
グラントサポート：NIH CA165263、NIH CA150197、NIH CA150197S1（HJクン）、NIH CA150197S1（CA Changou）、NSF PHY-0120999 バイオフォトニクス科学技術 （DLウォルフソン、FYS荘）、DOD PC073420（RJ太字）、研究センターノルウェーの評議会、Leivエリクソントラベルグラント209286/F11（BSアルワリア）。 HJクンもオーバーンコミュニティがん基金基金の支援を認めるものです。 RJ太字またJ.マクドナルド寄付の支援を認めるものです。
私たちは、ADIの寛大な供給のためDesigneRx博士ジェニー魏ジェンクン博士とボル·ウェンウーに感謝します。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Arginine Deiminase (ADI) | DesigneRx | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | 4042 | |
| Saponin | Sigma | S4521 | |
| Alexa anti-mouse 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Alexa anti-rabbit 647 | Invitrogen | A21244 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| anti-Lamp1 | DSHB | H4A3 | |
| anti-Cadherin | Cell Signaling | #3195 | |
| SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | |
| 35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate | MatTek | P35GC-1.5-1.4-C | |
| No.1, 22 mm coverslip | Corning | #2865-22 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1324G |
Referências
- Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis. Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).
- Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line. Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).
- Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism. Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).
- Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes. Biochimie. 90, 313-323 (2008).
- Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L). Autophagy. 3, 374-376 (2007).
- Crighton, D., Wilkinson, S., O’Prey, J., et al. DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis. Cell. 126, 121-134 (2008).
- Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation. Cancer. 100, 826-833 (2004).
- Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host & Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
- Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).
- York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).
