Análisis cuantitativo de la autofagia mediante microscopía de fluorescencia avanzada 3D
Summary
La autofagia es un proceso ubicuo que permite a las células para degradar y reciclar las proteínas y orgánulos. Aplicamos microscopía de fluorescencia avanzada para visualizar y cuantificar la pequeña, pero, cambios físicos esenciales asociados con la inducción de la autofagia, incluyendo la formación y distribución de autofagosomas y lisosomas, y su fusión en autolisosomas.
Abstract
El cáncer de próstata es la forma principal de cánceres entre los hombres en los EE.UU. Mientras que la cirugía conlleva un riesgo significativo de la impotencia y la incontinencia, los enfoques quimioterapéuticos tradicionales no han tenido éxito. La terapia hormonal es efectiva en una etapa temprana, pero a menudo se produce el eventual desarrollo de tumores hormono-refractario. Hemos estado interesados en el desarrollo de terapias dirigidas a la deficiencia metabólica específica de las células tumorales. Recientemente, hemos mostrado que las células de tumor de próstata específicamente carecen de una enzima (argininosuccinato sintasa, o ASS) que participan en la síntesis del aminoácido arginina 1. Esta condición hace que las células tumorales a ser dependiente de arginina exógena, y se someten a estrés metabólico cuando arginina libre se agota por la arginina deiminasa (ADI) 1,10. En efecto, hemos demostrado que las células de cáncer de próstata humano CWR22 RV1 mueren eficazmente por ADI con la apoptosis independiente de caspasas y autopha agresivagía (o macroautofagia) 1,2,3. La autofagia es un proceso evolutivamente conservada que permite a las células para metabolizar las proteínas no deseadas por la descomposición lisosomal durante la hambruna nutricional 4,5. Aunque los componentes esenciales de esta vía son bien caracterizados 6,7,8,9, muchos aspectos del mecanismo molecular aún no están claros – en particular, ¿cuál es el papel de la autofagia en la muerte-la respuesta de las células del cáncer de próstata después del tratamiento ADI ? Para abordar esta cuestión, se requiere un método experimental para medir el nivel y el alcance de la respuesta de la autofagia en las células – y puesto que no hay marcadores moleculares conocidos que pueden rastrear con precisión este proceso, se optó por desarrollar un enfoque de imágenes basada en el uso de microscopía de fluorescencia cuantitativa 3D 11,12.
Usando CWR22Rv1 células específicamente marcados con sondas fluorescentes para autofagosomas y lisosomas, se muestra que las pilas de imágenes 3D adquiridos, ya sea con widefield microscopía de deconvolución (y más tarde, con super-resolución, microscopía estructurada-iluminación) puede capturar claramente las primeras etapas de inducción de la autofagia. Con aplicaciones de análisis de imágenes digitales disponibles en el mercado, podemos obtener fácilmente la información estadística sobre el número autofagosoma y lisosoma, el tamaño, la distribución, y el grado de colocalización de cualquier célula con imagen formada. Esta información nos permite rastrear con precisión el progreso de la autofagia en las células vivas y permite que nuestra investigación continua sobre el papel de la autofagia en la quimioterapia del cáncer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mientras que la observación directa de las células marcadas con sondas fluorescentes contra LC3 es ampliamente aceptado como un método estándar para confirmar la respuesta autofagia 6, cuantitativa imágenes en 3D del mismo sistema (como lo hemos hecho) proporciona información y detalles sin precedentes sobre el complejo proceso de autofagia celular . En particular, se observa que cientos (si no miles) de autofagosomas en células vivas se forman dentro de 80 min de la inducción de la autofagia. Del mis…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Subvención de apoyo: NIH CA165263, CA150197 NIH, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0120999 Centro de Biofotónica Ciencia y Tecnología (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ negrita), La Investigación Consejo de Noruega, Leiv Eiriksson Beca de Viaje 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung agradece también el apoyo de la Comunidad al Fondo de Dotación cáncer Auburn. RJ Negrita también reconoce el apoyo de la J. McDonald dotación.
Damos las gracias a la Dra. Jenny Wei-Jen Kung y el Dr. Bor-wen Wu en DesigneRx para el suministro abundante de ADI.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Arginine Deiminase (ADI) | DesigneRx | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | 4042 | |
| Saponin | Sigma | S4521 | |
| Alexa anti-mouse 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Alexa anti-rabbit 647 | Invitrogen | A21244 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| anti-Lamp1 | DSHB | H4A3 | |
| anti-Cadherin | Cell Signaling | #3195 | |
| SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | |
| 35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate | MatTek | P35GC-1.5-1.4-C | |
| No.1, 22 mm coverslip | Corning | #2865-22 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1324G |
Referências
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