Super-oppløsning Imaging av Bakteriell divisjon Machinery

Summary

Vi beskriver en super-oppløsning avbildningsmetode å sondere strukturelle organisering av den bakterielle FtsZ-ringen, en essensiell apparat for celledeling. Denne metoden er basert på kvantitative analyser av photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM) bilder og kan brukes til andre bakterielle cytoskeletal proteiner.

Abstract

Bakteriell celledeling krever koordinert montering av mer enn ti viktige proteiner på midcell ^1,2. Sentralt i denne prosessen er dannelsen av en ring-lignende suprastructure (Z-ringen) av FtsZ protein ved divisjonen planen ^3,4. Z-ringen består av flere enkelt-trådede FtsZ protofilamenter, og forstå arrangementet av protofilamenter inni Z-ringen vil gi innsikt i mekanismen av Z-ringen montering og dets funksjon som en kraft generator ^5,6. Denne informasjonen har vært unnvikende på grunn av gjeldende begrensninger i konvensjonell fluorescens mikroskopi og elektronmikroskopi. Konvensjonell fluorescensmikroskopi er stand til å gi et bilde med høy oppløsning av Z-ringen på grunn av diffraksjon grensen av lys (~ 200 nm). Elektron cryotomographic bildebehandling har oppdaget spredt FtsZ protofilamenter i små C. crescentus celler ^7, men er vanskelig å anvende på større celler somE. coli eller B. subtilis. Her beskriver vi anvendelse av en super-oppløsning fluorescensmikroskopi metoden, Photoactivated Localization Mikroskopi (PALM) kvantitativt karakterisere strukturelle organisering av E. coli Z-ring ^8.

PALM bildebehandling tilbyr både høy romlig oppløsning (~ 35 nm) og spesifikk merking for å aktivere entydig identifisering av mål proteiner. Vi merket FtsZ med photoactivatable fluorescerende protein mEos2, som skifter fra grønt fluorescens (eksitasjon = 488 nm) til rødt fluorescens (eksitasjon = 561 nm) ved aktivering ved 405 nm ^9. Under en PALM eksperiment, er enkle FtsZ-mEos2 molekyler stokastisk aktivert og de tilsvarende Tyngdepunktet posisjonene til de enkle molekyler er bestemt med <20 nm presisjon. En super-oppløsning av Z-ringen blir deretter rekonstruert av superimposing sentroiden posisjonene alle oppdagede FtsZ-mEos2 molekyler.

<p class = "jove_content"> Ved hjelp av denne metoden, har vi funnet at Z-ringen har en fast bredde på ~ 100 nm, og er sammensatt av en løs samling av FtsZ protofilamenter som overlapper med hverandre i tre dimensjoner. Disse dataene gir et utgangspunkt for videre undersøkelser av cellesyklusen avhengige endringer av Z-ringen ¹⁰ og kan anvendes for andre proteiner av interesse.

Protocol

1. Prøvepreparering Inokuler LB media med en enkelt koloni av stamme JB281 [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. Vokse over natten i en shaker ved 37 ° C. Fortynne kulturen 1:1.000 inn M9 + minimal media [M9 salter, 0,4% glukose, 2 mM MgSo4, 0,1 mm 2 CaCl, MEM aminosyrer og vitaminer] og vokse til midten log fase (OD 600 = 0,2 til 0,3) i nærvær av kloramfenikol (150 ug / ml) ved romtemperatur (RT). Fremkall kultur med 20 mikromet…

Representative Results

Illustrert i fig 3Aiv er en to-dimensjonal, super-oppløsning gjengivelse av Z-ringen som genereres fra PALM avbildningsmetode beskrevet ovenfor. Nedenfor oppsummerer vi kvalitativ og kvantitativ informasjon som kan hentes fra dem. Kvalitativt, observerte vi at Z-ringen er en uregelmessig struktur som vedtar flere konfigurasjoner (enkelt band eller spiralformede bue) som ikke kan skilles i konvensjonelle fluorescens bilder (sammenlign figur 3A-Dii og <strong…

Discussion

PALM bildene inneholder informasjon om molekyl teller og stillinger innenfor en celle, slik at detaljert analyse av fordelingen og arrangement av target proteinmolekyler som er vanskelig å oppnå på annen måte. Nedenfor skisserer vi forholdsregler som bør tas for å trekke nøyaktig kvantitativ informasjon og samtidig opprettholde det biologiske relevansen av PALM bilder. Vi har også utforske informasjon som kan være best oppnås ved hjelp av levende vs fast celler. Endelig foreslår vi veier for å skaffe ekstra …

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
50 x MEM Amino Acids	Sigma	M5550
100 x MEM Vitamins	Sigma	M6895
IPTG	Mediatech	46-102-RF
16% Paraformaldehyde	Electron Micrsocopy Sciences	15710-S
SeaPlaque GTG Agarose	Lonzo	50111
50 nm Gold Beads	Microspheres-Nanospheres	790113-010
FCS2 Imaging Chamber	Bioptechs
Stage Adaptor	ASI	I-3017
Inverted Microscope	Olympus	IX71
1.45 NA, 60x Objective	Olympus
IXON EMCCD Camera	Andor Technology	DU897E
488-nm Sapphire Laser	Coherent
561-nm Sapphire Laser	Coherent
405-nm CUBE Laser	Coherent