Undersøqelse DNA-skader i hippocampus neuroner Brug af Comet Assay
Summary
Det comet assay er en effektiv måde til afsløring af enkelt-og dobbelt-streng pauser, herunder alkali-labile sites og DNA-DNA/DNA-protein tværbindinger på DNA i alle celler, herunder hippocampus neuroner. Fremgangsmåden drager fordel af den differentielle vandring af DNA i et elektrisk felt på grund af forskelle i mængden af DNA-beskadigelse.
Abstract
En række lægemidler rettet mod de DNA-reparationsmekanismer og inducerer celledrab ved at skabe DNA-beskadigelse. Således har fremgangsmåder til direkte måler DNA-skader blevet omfattende evalueret. Traditionelle metoder er tidskrævende, dyre, ressource-intensive og kræver replikerende celler. I modsætning hertil er comet assay, en enkelt celle gelelektroforese assay, en hurtigere, non-invasiv, billig, direkte og følsomt mål for DNA-skader og reparation. Alle former for DNA-skader samt DNA-reparation kan visualiseres på enkelt celle niveau ved hjælp af dette kraftfulde teknik.
Princippet for kometen assay er, at intakt DNA er meget ordnet hvorimod DNA-skader forstyrrer denne organisation. De beskadigede DNA trænger ind i agarosematrix og når den udsættes for et elektrisk felt, det negativt ladede DNA vandrer mod katoden, som er positivt ladet. De store ubeskadigede DNA-strenge er ikke i stand til at migrere langt fra kernen. DNA-beskadigelseskaber mindre DNA-fragmenter, der rejser længere end den intakte DNA. Comet assay, et billedanalyse-software, foranstaltninger og sammenligner den samlede fluorescerende intensitet af DNA'et i kernen med DNA, der er migreret ud af kernen. Fluorescerende signal fra migrerede DNA er proportional med DNA-beskadigelse. Længere lysere DNA hale betyder øget DNA-skader. Nogle af de parametre, der måles, er tail moment, som er et mål for både mængden af DNA og fordeling af DNA i halen, halelængde og procentdel af DNA i halen. Dette assay kan måle DNA-reparation samt da opløsning af DNA-skader betyder reparationen har fundet sted. Grænsen for følsomhed er omkring 50 strengbrud pr diploid pattedyrcelle 1,2. Celler behandles med DNA-beskadigende midler, såsom etoposid, kan anvendes som en positiv kontrol. Således comet assay er en hurtig og effektiv procedure til at måle DNA-skader.
Protocol
Discussion
Den comet assay har den unikke evne til at analysere de enkelte celler. Dette er fordelagtigt i identifikationen af subpopulationer af celler, der viser forskellen reaktion på cytotoksiske midler. Nogle få praktiske begrænsninger skal tages i betragtning. Antallet af celler, som kan evalueres individuelt kan variere afhængigt af individet. Prøvens størrelse skal øges, hvis der er varians i DNA-skader inden for en population. Levedygtig enkelt-cellesuspension er kritisk for dette assay, da fremherskende tils…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af IMPACT Award fra Institut for Radiation Oncology, University of Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, Fighting Børnecancerfonden, og Gabrielles Angel Foundation (til ESY.).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
Referências
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology. Mol. Cytogenet. 3, (2010).
- Olive, P. L. The comet assay. An overview of techniques. Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).
- Olive, P. L. Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation. Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).
- Olive, P. L. Impact of the comet assay in radiobiology. Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).
- Olive, P. L., Banath, J. P. Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin. Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).
- Olive, P. L., Durand, R. E. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry A. 66, 1-8 (2005).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair. Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).
- Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O’Neill, K. L. The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).
- Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons. Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).
- Yang, E. S., et al. Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice. The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).
- Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study. Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).
- Smith, C. C., O’Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).
- Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).
- Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
- Bonner, W. M., et al. [gamma]H2AX and cancer. Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).
- Finney, M. Pulsed Field Gel Electrophoresis. Current protocols in molecular biology. , (2000).
- Electrophoresis, F. I., et al. . Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).
- Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. , (2011).
