Analysere DNA-skader i hippocampus Neurons kometsystemet
Summary
Kometen analysen er en effektiv måte å oppdage enkelt-og dobbelt-tråd pauser, inkludert alkali-labile områder og DNA-DNA/DNA-protein kryssbindinger på DNA i alle celler, inkludert hippocampus nevroner. Metoden utnytter differensial migrasjon av DNA i et elektrisk felt på grunn av forskjeller i mengden av DNA-skade.
Abstract
En rekke medikamenter rettet mot de DNA-reparasjon stier og overtale celle drepe ved å opprette DNA-skader. Dermed har prosesser å direkte måle DNA skade blitt omfattende vurdert. Tradisjonelle metoder er tidkrevende, dyrt, ressurskrevende og krever Replikere celler. I motsetning er kometmetode, en enkelt celle gelelektroforese analysen, en raskere, non-invasiv, billig, direkte og følsom mål på DNA skade og reparasjon. Alle former for DNA-skade, så vel som DNA-reparasjon kan visualiseres på enkelt celle-nivå ved hjelp av denne kraftig teknikk.
Prinsippet kometen analysen er at intakt DNA svært bestilt mens DNA-skader forstyrrer denne organisasjonen. Den skadede DNA siver inn i agarose matrisen og når den utsettes for et elektrisk felt, vandrer negativt ladet DNA mot katoden som er positivt ladet. De store uskadet DNA-strengene er ikke i stand til å migrere langt fra kjernen. DNA-skaderlager mindre DNA-fragmenter som reise lenger enn den intakte DNA. Kometmetode, en bildeanalyse programvare, tiltak og sammenligner den samlede fluorescerende intensiteten av DNA i kjernen med DNA som har vandret ut av kjernen. Fluorescenssignalet fra migrert DNA er proporsjonal til DNA-skade. Lengre lysere DNA halen betyr økt DNA-skader. Noen av parametrene som er målt, er halen øyeblikket som er et mål på både mengden av DNA og distribusjon av DNA i halen, hale lengde og prosentandel av DNA i halen. Denne analysen gjør det mulig å måle DNA reparasjon samt siden oppløsningen av DNA skade betyr reparasjon har funnet sted. Grensen for følsomhet er ca 50 tråd pauser per diploid pattedyrcelle 1,2. Celler behandles med DNA skadelige midler, slik som etoposid, kan anvendes som en positiv kontroll. Dermed kometanalysen er en rask og effektiv prosedyre for å måle DNA-skader.
Protocol
Discussion
Kometen analysen har den unike evnen til å analysere individuelle celler. Dette er fordelaktig i identifikasjon av subpopulasjoner av celler som demonstrerer differensial respons overfor cytotoksiske midler. Noen praktiske begrensninger må tas i betraktning. Antall celler som kan bli vurdert individuelt kan variere avhengig av den enkelte. Prøven størrelse må økes hvis det er avvik i DNA skade innen en populasjon. Levedyktig encellede suspensjon er avgjørende for denne analysen siden dominerende tilstedeværelse …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av IMPACT Award fra Institutt for Radiation Oncology, University of Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, Fighting Barnas Cancer Foundation, og Gabrielle Angel Foundation (til Esy.).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
Referências
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology. Mol. Cytogenet. 3, (2010).
- Olive, P. L. The comet assay. An overview of techniques. Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).
- Olive, P. L. Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation. Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).
- Olive, P. L. Impact of the comet assay in radiobiology. Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).
- Olive, P. L., Banath, J. P. Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin. Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).
- Olive, P. L., Durand, R. E. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry A. 66, 1-8 (2005).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair. Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).
- Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O’Neill, K. L. The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).
- Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons. Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).
- Yang, E. S., et al. Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice. The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).
- Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study. Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).
- Smith, C. C., O’Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).
- Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).
- Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
- Bonner, W. M., et al. [gamma]H2AX and cancer. Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).
- Finney, M. Pulsed Field Gel Electrophoresis. Current protocols in molecular biology. , (2000).
- Electrophoresis, F. I., et al. . Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).
- Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. , (2011).
