Ensayo de daño del ADN en las neuronas del hipocampo utilizando el ensayo cometa
Summary
El ensayo cometa es una manera eficaz de detectar saltos de simple y doble hebra, incluyendo álcali-lábiles y sitios DNA-DNA/DNA-protein enlaces cruzados en el ADN en todas las células incluyendo neuronas del hipocampo. El método se aprovecha de la migración diferencial de ADN en un campo eléctrico debido a las diferencias en la cantidad de daño en el DNA.
Abstract
Un número de medicamentos se dirigen las rutas de reparación de ADN e inducir la muerte celular mediante la creación de daños en el ADN. Así, los procesos para medir directamente el daño del ADN han sido ampliamente evaluados. Los métodos tradicionales requieren mucho tiempo, los recursos costosos, y requieren células en replicación. En contraste, el ensayo de cometa, un gel de una sola célula del ensayo de electroforesis, es más rápido, no invasivo, de bajo costo medida, directa y sensible de daño y reparación del ADN. Todas las formas de daño en el ADN, así como la reparación del ADN puede ser visualizado en el nivel de células individuales utilizando esta técnica de gran alcance.
El principio que subyace a la prueba del cometa es que el ADN intacto es muy ordenado, mientras que el daño del ADN altera esta organización. Las filtraciones de ADN dañado en la matriz de agarosa y cuando se somete a un campo eléctrico, el ADN cargado negativamente migra hacia el cátodo, que está cargado positivamente. Las hebras grandes no dañadas de ADN no son capaces de migrar lejos del núcleo. Daño en el DNAcrea pequeños fragmentos de ADN, que pueden desplazarse más lejos que el ADN intacto. Comet Assay, un software de análisis de imagen, y compara las medidas de la intensidad global fluorescente del ADN en el núcleo con ADN que ha migrado fuera del núcleo. Señal fluorescente del ADN migrado es proporcional al daño del ADN. Brillante cola más larga de ADN significa un mayor daño del ADN. Algunos de los parámetros que se miden son momento de la cola, que es una medida tanto de la cantidad de ADN y la distribución de ADN en la longitud de la cola de la cola, y el porcentaje de ADN en la cola. Este ensayo permite medir la reparación del ADN, así ya que la resolución de daños en el ADN significa reparación ha tenido lugar. El límite de sensibilidad es de aproximadamente 50 roturas de cadena por célula diploide 1,2 mamíferos. Las células tratadas con agentes que dañan el ADN, tales como etopósido, se puede utilizar como un control positivo. Así, el ensayo cometa es un procedimiento rápido y eficaz para medir el daño del ADN.
Protocol
Discussion
El ensayo de cometa tiene la capacidad única de análisis de células individuales. Esto es ventajoso en la identificación de las subpoblaciones de células que muestran una respuesta diferencial a los agentes citotóxicos. A pocas limitaciones prácticas tienen que ser tomadas en cuenta. El número de células que pueden ser evaluados individualmente puede variar dependiendo de la persona. El tamaño de la muestra debe ser mayor si existe una variación en el daño del ADN dentro de una población. Viable sola célul…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Impact Award del Departamento de Oncología de Radiación de la Universidad de Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, la Fundación de Niños con Cáncer de lucha, y el Ángel de Gabrielle Foundation (para ESY.).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
Referências
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology. Mol. Cytogenet. 3, (2010).
- Olive, P. L. The comet assay. An overview of techniques. Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).
- Olive, P. L. Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation. Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).
- Olive, P. L. Impact of the comet assay in radiobiology. Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).
- Olive, P. L., Banath, J. P. Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin. Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).
- Olive, P. L., Durand, R. E. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry A. 66, 1-8 (2005).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair. Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).
- Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O’Neill, K. L. The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).
- Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons. Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).
- Yang, E. S., et al. Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice. The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).
- Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study. Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).
- Smith, C. C., O’Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).
- Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).
- Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
- Bonner, W. M., et al. [gamma]H2AX and cancer. Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).
- Finney, M. Pulsed Field Gel Electrophoresis. Current protocols in molecular biology. , (2000).
- Electrophoresis, F. I., et al. . Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).
- Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. , (2011).
