コメットアッセイを用いて海馬神経細胞のDNA損傷を測定する
1Department of Radiation Oncology,University of Alabama-Birmingham, 2Department of Radiation Oncology,The Ohio State University Medical School, 3Department of Cell Biology, and Pharmacology and Toxicology, Comprehensive Cancer Center,University of Alabama at Birmingham School of Medicine, University of Alabama-Birmingham
Summary
コメットアッセイは、アルカリに不安定なサイトや海馬ニューロンを含むすべての細胞のDNAにDNA-DNA/DNA-proteinクロスリンクを含むシングルと二重鎖切断を検出する効率的な方法です。この方法は、DNA損傷の量の違いに起因する電界中のDNAの差のマイグレーションを活用しています。
Abstract
多くの薬剤は、DNA修復経路を標的とし、細胞がDNA損傷を作成することによって殺す誘発する。したがって、直接DNA損傷を測定するためのプロセスが広く評価されている。従来の方法は時間がかかり、高価な、リソースを大量に消費され、複製細胞を必要とする。これとは対照的に、コメットアッセイ、単一細胞ゲル電気泳動アッセイは、DNA損傷と修復の高速化、非侵襲的、安価、直接的かつ敏感な尺度である。 DNA損傷だけでなく、DNA修復のすべてのフォームは、この強力な技術を用いて、単一細胞レベルで可視化することができる。
コメットアッセイの基礎となる原理は、DNA損傷がこの組織を混乱させるのに対し、無傷のDNAが高度に秩序化されています。損傷したDNAをアガロースマトリックスに汚水を垂れ流すと、電界にさらされたとき、負に荷電したDNAは正に帯電している陰極に向かって移動する。大きな損傷を受けていないDNA鎖は核から遠くに移行することはできません。 DNA損傷遠く無傷のDNAより旅行小さなDNA断片を作成します。コメットアッセイでは、画像解析ソフト、対策や核外移行したDNAを用いて核内のDNAの全体的な蛍光強度を比較します。移行されたDNAからの蛍光シグナルは、DNA損傷に比例します。長く明るいDNAテールは、増加したDNA損傷を意味します。測定されるパラメータの一部は、尾部のDNA量と尾、尾の長さのDNAの分布とDNAのパーセンテージの両方の尺度であるテールモーメントです。このアッセイは、DNA損傷の解像度は修理が行われたことを表しますので、同様にDNA修復を測定することができます。感度の限界は、二倍体の哺乳類細胞1,2あたり約50鎖の切断である。例えば、エトポシドなどの任意のDNA損傷剤で処理した細胞を、ポジティブコントロールとして使用することができる。したがって、コメットアッセイ、DNA損傷を測定するための迅速かつ効果的な手順です。
Protocol
1。細胞培養培養神経細胞および必要に応じてそれらを扱う。 15 mlチューブに細胞を回収します：吸引メディアは、リン酸でリンス液（PBS、カルシウム及びマグネシウムを含まない）緩衝生理食塩水、15 mlチューブに収集し、適切な血清含有培地にトリプシンを中和し、トリプシンを追加します。 5分間、1,000×gで遠心する。 メディアを吸引します。 PBSに?…
Discussion
コメットアッセイは、個々の細胞を分析するユニークな能力を持っています。これは、細胞毒性薬に反応差を実証する細胞の亜集団の同定に有利である。いくつかの実用的な制限は考慮に入れなければならない。個別に評価することができる細胞の数は、個々によって異なります。集団内のDNA損傷のばらつきがある場合にはサンプルサイズを増やす必要があります。壊死またはアポトーシス?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、放射線腫瘍学、アラバマバーミンガム大学総合がんセンター、ファイティングがんの子供を守る財団、ガブリエルのエンジェル財団（ESYへ。）の部門からインパクト賞によってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
Referências
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology. Mol. Cytogenet. 3, (2010).
- Olive, P. L. The comet assay. An overview of techniques. Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).
- Olive, P. L. Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation. Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).
- Olive, P. L. Impact of the comet assay in radiobiology. Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).
- Olive, P. L., Banath, J. P. Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin. Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).
- Olive, P. L., Durand, R. E. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry A. 66, 1-8 (2005).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair. Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).
- Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O’Neill, K. L. The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).
- Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons. Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).
- Yang, E. S., et al. Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice. The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).
- Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study. Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).
- Smith, C. C., O’Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).
- Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).
- Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
- Bonner, W. M., et al. [gamma]H2AX and cancer. Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).
- Finney, M. Pulsed Field Gel Electrophoresis. Current protocols in molecular biology. , (2000).
- Electrophoresis, F. I., et al. . Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).
- Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. , (2011).
Citar este artigo
Nowsheen, S., Xia, F., Yang, E. S. Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay. J. Vis. Exp. (70), e50049, doi:10.3791/50049 (2012).