ホールマウントRNAを蛍光<em>その場で</emの>ハイブリダイゼーション<em>ショウジョウバエ</em>胚
Summary
ここでは、ホールマウント蛍光を記述<em>その場で</emショウジョウバエの胚発生の間に発現したRNAの発現と局在特性を決定するための>ハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル、<em>キイロショウジョウバエ</em>。
Abstract
遺伝子の発現パターンだけでなく、その転写されたRNAの細胞内局在化特性を評価、開発中にその生物学的機能を理解するために重要な機能です。 in situハイブリダイゼーション 、RNA（RNA ISH）は、生物の、細胞または細胞内のレベル1でそれである、RNAの分布特性を可視化するために使用される強力な方法です。 RNA-ISHはmRNAまたは関心2の非コーディングRNA標的の配列に相補的な標識核酸プローブ（ 例えば、アンチセンスRNA、オリゴヌクレオチド）のハイブリダイゼーションに基づいています。手順は配列特異的なプローブを生成するために単独で一次配列情報を必要として、それは普遍的に生物や組織標本3の広い範囲に適用することができます。実際、大規模なISHの多くの研究がにつながっている様々なモデル生物における遺伝子発現とRNA局在化ダイナミクスを文書化するために実装されています重要な地域資源の確立4-11プローブのラベリングと検出、様々な戦略が長年にわたって開発されてきたが、蛍光標識された検出試薬と酵素信号増幅ステップの併用は、手順12の感度と分解能の大幅な機能強化を提供します。ここでは、段階的なショウジョウバエ胚におけるRNAの発現と局在の動態を可視化するためにチラミドシグナル増幅（TSA）を用いるin situハイブリダイゼーション法（FISH） に最適化された蛍光を記述します。手続きが大幅に多数のサンプルの同時処理を容易にする96ウェルPCRプレート形式で行われる。
Protocol
Representative Results
Discussion
プローブ合成の手順については、我々は通常、 ショウジョウバエ遺伝子コレクション（DGC）は、次のWebサイトで詳細なリソースで見つかったプラスミドから増幅された完全長cDNAからショウジョウバエのin vitro転写によりランオフアンチセンスRNAプローブを生成： のhttp://www .fruitfly.org / DGC / index.htmlを 14,15。このアプロ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
レキュヤー室で行った仕事は、国立科学とカナダの技術評議会（NSERC）、健康研究（CIHR）とフォン·ド·RECHERCHE専用サンテ·デュ·ケベック（FRSQ）のカナダの協会からの資金によってサポートされています。キャロルIampietroがアンジェロPizzagalliポスドクでサポートされていながら、ファビオアレクシスルフェーブルとガエル·Moquin·ボードリーは、NSERC学部研究studentshipsによってサポートされています。
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| T7, T3 or SP6 RNA Polymerase | Fermentas Life Sciences | EP0101,EP0111,EP0131 | Kits contain reaction buffer. |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Applied Science | 11 277 073 910 | |
| RNAguard | Amersham Biosciences | 27-0816-01 | |
| 3M sodium acetate | |||
| Cold 100% ethanol. | |||
| Cold 70% ethanol. | |||
| Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water. | |||
| Heptane | |||
| Methanol | |||
| proteinase K | Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada | Catalog No. P2308 | |
| 40% formaldehyde solution, freshly prepared | |||
| PBS-Tween solution (PBT) | 1xPBS, 0.1% Tween-20 | ||
| Glycine solution | 2 mg/ ml glycine in PBT | ||
| HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc | 200-032- 156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG | Roche Applied Science, Laval, QC | 1 207 733 | 1/500 dilution of stock solution in PBTB |
| Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 200-062-156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| Streptavidin-HRP conjugate | Molecular Probes, Eugene OR, USA | S991 | (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock |
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