كله جبل RNA نيون<em> في الموقع</em> التهجين من<em> ذبابة الفاكهة</em> الأجنة
Summary
نحن هنا وصف كامل الفلورسنت جبل<em> في الموقع</em> التهجين (FISH) لتحديد بروتوكول خصائص التعبير والترجمة من RNAs أعرب خلال مرحلة التطور الجنيني في ذبابة الفاكهة،<em> ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em>.
Abstract
تقييم نمط التعبير عن الجينات، وكذلك توطين التحت خلوية خصائص الحمض النووي الريبي في نسخها، هي الملامح الرئيسية لفهم وظيفتها البيولوجية خلال التنمية. RNA في الموقع التهجين (RNA-ISH) هو وسيلة قوية تستخدم لتصور خصائص توزيع RNA، سواء كان ذلك على المستوى العضوي أو الخلوي التحت خلوية 1. ويستند RNA-ISH على تهجين الحمض النووي تحقيقا المسمى (مثل العقاقير RNA، أليغنوكليوتيد]) مكملة لسلسلة من مرنا أو RNA هدفا غير الترميز من الفائدة 2. كما يتطلب الإجراء الأساسي وحده تسلسل المعلومات لتوليد تسلسل محدد تحقيقات، فإنه يمكن تطبيقها عالميا لطائفة واسعة من الكائنات الحية وعينات الأنسجة 3. وبالفعل، تم تنفيذ عدد من الدراسات على نطاق واسع لتوثيق ISH التعبير الجيني والحمض النووي الريبي ديناميات توطين الكائنات الحية في نموذج مختلف، مما أدى إلىإنشاء موارد المجتمع المهم 4-11. في حين وضعت مجموعة متنوعة من العلامات التحقيق والكشف عن استراتيجيات على مر السنين، جنبا إلى جنب من استخدام الكواشف كشف fluorescently-صفت والأنزيمية خطوات التضخيم إشارة تقديم تحسينات كبيرة في الحساسية وقرار إجراء 12. هنا، ونحن تصف طريقة الفلورسنت الأمثل في الموقع التهجين (FISH) توظيف tyramide التضخيم إشارة (TSA) لتصور RNA التعبير وديناميات التوطين في الأجنة ذبابة الفاكهة على مراحل. يتم تنفيذ الإجراء في 96-PCR كذلك شكل لوحة، مما يسهل كثيرا من المعالجة المتزامنة لعدد كبير من العينات.
Protocol
Representative Results
Discussion
للحصول على خطوات تركيب التحقيق، ونحن عادة ما تولد جريان تحقيقات RNA مضاد من قبل في النسخ المختبر من cDNAs ذبابة الفاكهة كامل طول تضخيم من البلازميدات وجدت في مجموعة جين ذبابة الفاكهة (DGC)، موردا بالتفصيل على الموقع التالي: <a href="http://www.fruitfly.org/DGC/index.html" targe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم عمل أجريت في المختبر Lécuyer بتمويل من علوم والهندسة الوطنية مجلس كندا (NSERC)، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR) ودي فون بحوث EN سانتيه كيبيك (FRSQ). ويدعم فابيو الكسيس يفبفر وجايل Moquin-Beaudry من NSERC دراسية البحوث الجامعية، في حين يتم اعتماد كارول Iampietro من الزمالة ما بعد الدكتوراه Pizzagalli انجيلو.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| T7, T3 or SP6 RNA Polymerase | Fermentas Life Sciences | EP0101,EP0111,EP0131 | Kits contain reaction buffer. |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Applied Science | 11 277 073 910 | |
| RNAguard | Amersham Biosciences | 27-0816-01 | |
| 3M sodium acetate | |||
| Cold 100% ethanol. | |||
| Cold 70% ethanol. | |||
| Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water. | |||
| Heptane | |||
| Methanol | |||
| proteinase K | Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada | Catalog No. P2308 | |
| 40% formaldehyde solution, freshly prepared | |||
| PBS-Tween solution (PBT) | 1xPBS, 0.1% Tween-20 | ||
| Glycine solution | 2 mg/ ml glycine in PBT | ||
| HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc | 200-032- 156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG | Roche Applied Science, Laval, QC | 1 207 733 | 1/500 dilution of stock solution in PBTB |
| Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 200-062-156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| Streptavidin-HRP conjugate | Molecular Probes, Eugene OR, USA | S991 | (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock |
Referências
- Wilcox, J. N. Fundamental principles of in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
- Lecuyer, E., Tomancak, P. Mapping the gene expression universe. Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).
- Tomancak, P., et al. Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).
- Thisse, B., et al. Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening. Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).
- Quiring, R., et al. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
- Pollet, N., et al. An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis. Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
- Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
- Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312, 1183-1187 (2006).
- Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos. Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).
- Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O’Farrell, P. H., Davis, I. Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei. Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).
- Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo dechorionation. CSH Protoc. , (2007).
- Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).
- Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287, 2222-2224 (2000).
- Tomancak, P., et al. Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 3, (2002).
- Terashima, J., Bownes, M. Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster. Genética. 167, 1711-1719 (2004).
- Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).
- Lecuyer, E. High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila. Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).
- Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846 (2004).
