Hele Mount RNA Fluorescent<em> In situ</em> Hybridisering af<em> Drosophila</em> Embryoner
Summary
Her beskriver vi en hel-mount fluorescerende<em> In situ</em> Hybridisering (FISH)-protokollen til bestemmelse af udtrykket og lokalisering egenskaber af RNA'er udtrykt under embryogenese hos bananfluen,<em> Drosophila melanogaster</em>.
Abstract
Vurdering af ekspressionsmønstret af et gen, såvel som de subcellulære lokalisering egenskaber af sine transskriberede RNA, er vigtige funktioner til at forstå dens biologiske funktion under udvikling. RNA in situ hybridisering (RNA-ISH) er en kraftfuld metode, der anvendes til at visualisere RNA fordeling egenskaber, det være sig på de organismal, cellulære eller subcellulære niveauer 1. RNA-ISH er baseret på hybridiseringen af en mærket nukleinsyreprobe (fx antisense-RNA, oligonucleotider) komplementær til sekvensen af et mRNA eller et ikke-kodende RNA-mål af interesse 2. Da proceduren kræver primære sekvensinformation alene at generere sekvensspecifikke prober, kan det generelt anvendes i en bred vifte af organismer og vævsprøver 3. Faktisk har en række store ISH undersøgelser blevet gennemført for at dokumentere genekspression og RNA lokalisering dynamik i forskellige modelorganismer, hvilket har ført tiletablering af vigtige samfunds ressourcer 4-11. Mens en række af sonde mærkning og detektion strategier er blevet udviklet gennem årene, den kombinerede anvendelse af fluorescens-mærkede påvisningsreagenser og enzymatiske signalforstærkning trin giver betydelige forbedringer i følsomhed og opløsning af proceduren 12. Her beskriver vi en optimeret fluorescerende in situ-hybridisering fremgangsmåde (FISH) under anvendelse af tyramid signalforstærkning (TSA) for at visualisere RNA-ekspression og lokalisering dynamikken i iscenesatte Drosophila-embryoner. Fremgangsmåden udføres i 96-brønds PCR-plade-format, hvilket i høj grad letter samtidig behandling af et stort antal prøver.
Protocol
Representative Results
Discussion
For probe syntesetrin vi typisk genererer afløb antisense RNA-prober ved de vitro transkription fra fuld længde Drosophila cDNA'er amplificeret fra plasmider fundet i Drosophila Gene Collection (DGC), en ressource beskrevet på følgende websted: http://www .fruitfly.org / DGC / index.html 14,15. Denne fremgangsmåde har været brugt i udstrakt grad i store ISH undersøgelser med henblik på kortlæg…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet udføres i Lecuyer laboratorium er støttet af midler fra National Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), den canadiske Institutes of Health Research (CIHR) og Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ). Fabio Alexis Lefebvre og Gaël Moquin-Beaudry understøttes af NSERC bachelor forskning stipendier, mens Carole Iampietro støttes af Angelo Pizzagalli postdoc-stipendium.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| T7, T3 or SP6 RNA Polymerase | Fermentas Life Sciences | EP0101,EP0111,EP0131 | Kits contain reaction buffer. |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Applied Science | 11 277 073 910 | |
| RNAguard | Amersham Biosciences | 27-0816-01 | |
| 3M sodium acetate | |||
| Cold 100% ethanol. | |||
| Cold 70% ethanol. | |||
| Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water. | |||
| Heptane | |||
| Methanol | |||
| proteinase K | Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada | Catalog No. P2308 | |
| 40% formaldehyde solution, freshly prepared | |||
| PBS-Tween solution (PBT) | 1xPBS, 0.1% Tween-20 | ||
| Glycine solution | 2 mg/ ml glycine in PBT | ||
| HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc | 200-032- 156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG | Roche Applied Science, Laval, QC | 1 207 733 | 1/500 dilution of stock solution in PBTB |
| Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 200-062-156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| Streptavidin-HRP conjugate | Molecular Probes, Eugene OR, USA | S991 | (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock |
Referências
- Wilcox, J. N. Fundamental principles of in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
- Lecuyer, E., Tomancak, P. Mapping the gene expression universe. Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).
- Tomancak, P., et al. Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).
- Thisse, B., et al. Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening. Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).
- Quiring, R., et al. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
- Pollet, N., et al. An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis. Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
- Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
- Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312, 1183-1187 (2006).
- Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos. Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).
- Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O’Farrell, P. H., Davis, I. Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei. Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).
- Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo dechorionation. CSH Protoc. , (2007).
- Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).
- Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287, 2222-2224 (2000).
- Tomancak, P., et al. Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 3, (2002).
- Terashima, J., Bownes, M. Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster. Genética. 167, 1711-1719 (2004).
- Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).
- Lecuyer, E. High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila. Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).
- Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846 (2004).
