Whole Berg RNA Fluorescent<em> In situ</em> Hybridisierung<em> Drosophila</em> Embryonen
Summary
Hier beschreiben wir eine ganze-mount fluoreszierende<em> In situ</em> Hybridisierung (FISH)-Protokoll für die Bestimmung der Expression und Lokalisation Eigenschaften von RNAs während der Embryogenese in der Fruchtfliege ausgedrückt,<em> Drosophila melanogaster</em>.
Abstract
Beurteilung der Expression eines Gens, sowie der subzellulären Lokalisation Eigenschaften seiner transkribierte RNA, sind wesentliche Merkmale für das Verständnis seine biologische Funktion während der Entwicklung. RNA in situ Hybridisierung (RNA-ISH) ist eine leistungsfähige Methode zur Visualisierung von RNA Verteilung Eigenschaften verwendet, sei es bei den Organismen, Zellen oder subzellulären Ebene 1. RNA-ISH basiert auf der Hybridisierung einer markierten Nukleinsäure-Sonde (z. B. Antisense-RNA, Oligonukleotiden) komplementär zu der Sequenz eines mRNA oder eines nicht-kodierende RNA Ziel von Interesse 2 basiert. Da das Verfahren erfordert Primärsequenz Information allein zur sequenzspezifischen Sonden zu erzeugen, kann es allgemein zu einem breiten Spektrum von Organismen und Gewebeproben 3 angewendet werden. In der Tat, eine Reihe von großen ISH Studien durchgeführt wurden, um die Genexpression zu dokumentieren und RNA Lokalisation Dynamik in verschiedenen Modellorganismen hat sich auf das führteAufbau wichtiger Community-Ressourcen 4-11. Während eine Vielzahl von Sonden-Markierung und zum Nachweis Strategien im Laufe der Jahre entwickelt worden sind, bieten die kombinierte Verwendung von fluoreszenzmarkierten Nachweisreagenzien und enzymatische Signalverstärkung Schritte signifikante Verbesserungen der Empfindlichkeit und Auflösung des Verfahrens 12. Hier beschreiben wir eine optimierte Fluoreszenz in situ Hybridisierung Verfahren (FISH) unter Verwendung Tyramid Signalverstärkung (TSA), die RNA Expression und Lokalisation Dynamik inszeniert Drosophila-Embryonen zu visualisieren. Das Verfahren wird in 96-well PCR-Platte-Format, das erleichtert die gleichzeitige Verarbeitung einer großen Zahl von Proben durchgeführt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Für Sonde Syntheseschritte, wir erzeugen typischerweise Run-off-Antisense-RNA-Sonden durch in vitro Transkription von full-length Drosophila cDNAs von Plasmiden in der Drosophila Gene Collection (DGC), eine Ressource auf der folgenden Website detailliert gefunden amplifiziert: http://www .fruitfly.org / DGC / index.html 14,15. Dieser Ansatz wurde ausgiebig in großem Maßstab ISH Studium an Mapping-Genexpression u…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeiten durchgeführt im Lécuyer Labor wird durch Mittel aus dem Nationalen Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), dem kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) und dem Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) unterstützt. Fabio Alexis Lefebvre und Gaël Moquin-Beaudry von NSERC Undergraduate Research studentships unterstützt, während Carole Iampietro vom Angelo Pizzagalli Postdoc-Stipendium unterstützt wird.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| T7, T3 or SP6 RNA Polymerase | Fermentas Life Sciences | EP0101,EP0111,EP0131 | Kits contain reaction buffer. |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Applied Science | 11 277 073 910 | |
| RNAguard | Amersham Biosciences | 27-0816-01 | |
| 3M sodium acetate | |||
| Cold 100% ethanol. | |||
| Cold 70% ethanol. | |||
| Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water. | |||
| Heptane | |||
| Methanol | |||
| proteinase K | Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada | Catalog No. P2308 | |
| 40% formaldehyde solution, freshly prepared | |||
| PBS-Tween solution (PBT) | 1xPBS, 0.1% Tween-20 | ||
| Glycine solution | 2 mg/ ml glycine in PBT | ||
| HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc | 200-032- 156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG | Roche Applied Science, Laval, QC | 1 207 733 | 1/500 dilution of stock solution in PBTB |
| Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 200-062-156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| Streptavidin-HRP conjugate | Molecular Probes, Eugene OR, USA | S991 | (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock |
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