Tutta la Monte RNA fluorescente<em> In situ</em> L'ibridazione di<em> Drosophila</em> Embrioni
Summary
Qui si descrive un insieme di montaggio fluorescente<em> In situ</em> Ibridazione (FISH) protocollo per la determinazione delle proprietà di espressione e la localizzazione di RNA espressi durante l'embriogenesi nel moscerino della frutta,<em> Drosophila melanogaster</em>.
Abstract
Valutare il pattern di espressione di un gene, come pure le proprietà localizzazione subcellulare di suo RNA trascritti, sono caratteristiche essenziali per la comprensione della funzione biologica durante lo sviluppo. RNA ibridazione in situ (ISH-RNA) è un potente metodo utilizzato per visualizzare le proprietà di distribuzione di RNA, sia ai organismal, livelli cellulari o subcellulari 1. RNA-ISH si basa sulla ibridazione di una sonda di acido nucleico marcato (ad esempio RNA antisenso, oligonucleotidi) complementare alla sequenza di un mRNA o non codificante RNA bersaglio di interesse 2. Poiché la procedura richiede informazioni di sequenza primaria sola sequenza per generare sonde specifiche, può essere universalmente applicata a una vasta gamma di organismi e campioni di tessuto 3. Infatti, un certo numero di studi ISH larga scala sono state attuate per documentare l'espressione genica e RNA dinamiche localizzazione in vari organismi modello, che ha portato allacreazione di risorse comunitarie importanti 4-11. Mentre una serie di etichettatura sonda e strategie di rilevazione sono state sviluppate nel corso degli anni, l'uso combinato di reagenti di rivelazione in fluorescenza marcati enzimatici e di amplificazione di segnale offrono miglioramenti significativi della sensibilità e risoluzione del procedimento 12. Qui, descriviamo un metodo fluorescente ottimizzata de ibridazione in situ (FISH) utilizzando l'amplificazione del segnale tiramide (TSA) per visualizzare l'espressione di RNA e dinamica in scena localizzazione in embrioni di Drosophila. La procedura viene eseguita in formato a 96 pozzetti piastra PCR, che facilita notevolmente la lavorazione simultanea di un gran numero di campioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per la procedura di sintesi della sonda, di solito generano run-off sonde di RNA antisenso mediante trascrizione in vitro da full-length cDNA Drosophila amplificati da plasmidi presenti nel gene Drosophila Collection (DGC), una risorsa dettagliato al seguente indirizzo: http://www .fruitfly.org / DGC / index.html 14,15. Questo approccio è stato ampiamente utilizzato in grandi studi di ISH di scala volte a espressi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lavori realizzati in laboratorio Lécuyer è sostenuto da un finanziamento della Nazionale Scienze e Ingegneria Consiglio, del Canada (NSERC), il Canadian Institutes of Health Research (CIHR) e il Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ). Fabio Alexis Lefebvre e Gaël Moquin-Beaudry sono supportati da borse di ricerca NSERC universitari, mentre Carole Iampietro è supportato dalla borsa di studio post-dottorato Angelo Pizzagalli.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| T7, T3 or SP6 RNA Polymerase | Fermentas Life Sciences | EP0101,EP0111,EP0131 | Kits contain reaction buffer. |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Applied Science | 11 277 073 910 | |
| RNAguard | Amersham Biosciences | 27-0816-01 | |
| 3M sodium acetate | |||
| Cold 100% ethanol. | |||
| Cold 70% ethanol. | |||
| Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water. | |||
| Heptane | |||
| Methanol | |||
| proteinase K | Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada | Catalog No. P2308 | |
| 40% formaldehyde solution, freshly prepared | |||
| PBS-Tween solution (PBT) | 1xPBS, 0.1% Tween-20 | ||
| Glycine solution | 2 mg/ ml glycine in PBT | ||
| HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc | 200-032- 156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG | Roche Applied Science, Laval, QC | 1 207 733 | 1/500 dilution of stock solution in PBTB |
| Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 200-062-156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| Streptavidin-HRP conjugate | Molecular Probes, Eugene OR, USA | S991 | (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock |
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