Summary

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Published: February 02, 2013
doi:

Summary

אנו מתארים assay תא בודד תפוקה גבוהה למדוד cytotoxicity של תאי T כאשר דגר עם תאי המטרה סרטניים. שיטה זו מעסיקה, מערך אלסטומרי צפוף של תת nanoliter בארות (~ 100.000 / מערך בארות) מרחבית להגביל את תאי T ותאי מטרה ביחסים מוגדרים ומצמידה למיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לפקח נטייה-היעד פעיל ואפופטוזיס שלאחר מכן.

Abstract

טיפול חיסוני סרטן יכול לרתום את הספציפיות של תגובה חיסונית למקד ולחסל גידולים. טיפול בתאים מאמץ (ACT) המבוססים על העברת המאמצת של תאי T המהונדס גנטי כדי לבטא רצפטור אנטיגן chimeric (CAR) הראה הבטחה רבה במחקרים קליניים 1-4. ישנם מספר יתרונות לשימוש ברכב + תאי T לטיפול בסרטן, לרבות היכולת למקד אנטיגנים מוגבלים שאינם MHC וfunctionalize תאי T להישרדות אופטימלית, הביות והתמדה בתוך פונדקאי, ולבסוף לגרום לאפופטוזיס של מכונית + תאי T במקרה של רעילות מארח 5.

תיחום הפונקציות האופטימליות של רכב + תאי T הקשורים לתועלת קלינית הם חיוניים לעיצוב הדור הבא של ניסויים קליניים. התקדמות בהדמית חי כמו מיקרוסקופיה multiphoton חולל מהפכה בחקר תפקוד תא חיסוני אניn vivo 6,7. בעוד שמחקרים אלה קדמו את ההבנה של פונקציות תא T in vivo, ACT מבוסס תאי T בניסויים קליניים שלנו דורש את הצורך לקשר תכונות מולקולריות ופונקציונליות של הכנות תא T-עירוי מראש עם פוסט עירוי יעילות קלינית, על ידי ניצול ב מבחני חוץ גופיית ניטור תפקודי תא T כמו, והפרשת ציטוקינים cytotoxicity. מבחנים מבוססי הזרימה cytometry סטנדרטיים שפותחו לקבוע את התפקוד הכללי של אוכלוסיות תאי T ברמת התא בודד, אבל אלה אינם מתאימים לניטור צמודה והיווצרות חיים או את היכולת של אותו התא כדי להרוג מטרות מרובות 8.

מערכי microfabricated תוכננו בפולימרים ביולוגיים כמו polydimethylsiloxane (PDMS) הם שיטה אטרקטיבית במיוחד מרחבית להגביל effectors ויעדים בנפחים קטנים 9. בשילוב עם מיקרוסקופיה אוטומטית זמן לשגות פלואורסצנטי, thousands של אינטראקציות-היעד פעיל ניתן לפקח בו זמנית על ידי בארות בודדות הדמיה של מערך nanowell. אנו מציגים כאן שיטת תפוקה גבוהה לניטור cytotoxicity תיווך תאי T ברמת התא בודד שיכול להיות מיושמת באופן נרחב ללימוד הפונקציונלי cytolytic תאי טי.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים הכן RPMI-PLGH ידי ערבוב 500 מיליליטר מיליליטר RPMI-1640 ו 5 כל אחד מפניצילין-סטרפטומיצין, L-גלוטמין, ופתרון HEPES. הכן R10 פתרון על ידי ערבוב RPMI-PLGH עם סרום שור עוברי (10% FBS). FBS הוא חום מומת בגיל …

Representative Results

דוגמה ליישום של assay cytolytic התפוקה הגבוהה באה לידי ביטוי באיור 2. בקצרה, שכותרת CAR CD19 ספציפי + תאי T נלקחו ביחד עם מודגרות-EL4 תאי מטרת עכבר שכותרתו בבארות הבודדות של מערך nanowell (סעיפים 1-5). תמונה ראשונית נרשמה במיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי כדי לזהות את התפוס?…

Discussion

נציין כאן את הפרוטוקול לבדיקת cytolytic תפוקה גבוהה מתא בודד אפשרה באמצעות שיתוף דגירה של effectors ויעדים במערכים של nanowells (איור 1). בנוסף לתפוקת יתרון עיקרי של השיטה הוא היכולת לנטר cytotoxicity פעיל בתיווך כנגד תאי המטרה רצויה ללא צורך בהנדסת תא היעד אשר בתורו מאפשר לשימ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחקר דיווח בפרסום זה היה נתמך על ידי מכון הלאומי לחקר הסרטן של המכון הלאומי לבריאות תחת מספר הפרס R01CA174385. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
RPMI-1640 w/o L-glutamine Cellgro 15-040-CV  
Penicillin-streptomycin Cellgro 30-002-CI 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin
L-glutamine Cellgro 25-005-CI 200 mM solution
HEPES Sigma Aldrich H3537 1M
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150 Lot tested
Cell Tracker Red Stain Invitrogen C34552 50 μg
Vybrant DyeCycle Violet Stain Invitrogen V35003 5 mM
SYTOX green Nucleic Acid Stain Invitrogen S7020 5 mM
Annexin V-Alexa Fluor 647 Invitrogen A23204 500 μl
Dulbecco’s PBS Cellgro 21-031-CV 500 ml
Noble agar DIFCO 2M220 100 g
Trypan Blue Sigma Aldrich T8154 0.4% liquid, sterile filtered
Hemocytometer Hausser Scientifics 1492 Bright line
4-well plate Thermo Fisher 167603  
Harrick Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-32G Basic plasma cleaner
Observer.Z1 ZEISS   Fluorescent microscope (works with the three parts below)
Lambda 10-3 Sutter Instrument   Filter controller
Lambda DG-4 Sutter Instrument   Ultra-High-Speed Wavelength switcher
Hamamatsu EM-CCD Camera Hamamatsu C9100-13 CCD-Microscope camera
15 ml conical tube BD Falcon 352097  
50 ml conical tube VWR 3282-345-300  
Nikon Biostation Nikon Instruments Inc. Biostation IM  
Glass bottom culture dish MatTek Corporation P35G-0 35 mm petri dish, 10 mm microwell

Referências

  1. Louis, C. U., et al. Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma. Blood. 118, 6050-6056 (2011).
  2. Savoldo, B., et al. CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients. J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).
  3. Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).
  4. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia. N. Engl. J. Med. , (2011).
  5. Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).
  6. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  7. Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
  8. Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).
  9. Varadarajan, N., et al. A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis. J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).
  10. Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies. Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).
  11. Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research. Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).
  12. Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).
  13. Makedonas, G., Betts, M. R. Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV. Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).
  14. Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry. Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).

Play Video

Citar este artigo
Liadi, I., Roszik, J., Romain, G., Cooper, L. J., Varadarajan, N. Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells. J. Vis. Exp. (72), e50058, doi:10.3791/50058 (2013).

View Video