Procedure for Decellularization af porcin Heart ved retrograd Coronarperfusionstrykket
Summary
En fremgangsmåde til hurtigt og fuldstændigt fjerne cellulære bestanddele fra en intakt porcin hjerte via retrograd perfusion beskrives. Denne metode giver en stedsspecifik hjerte ekstracellulær matrix stillads, der har potentiale til brug i flere kliniske anvendelser.
Abstract
Perfusion baseret helt organ decellularization har for nylig fået interesse inden for tissue engineering som et middel til at skabe stedspecifikke ekstracellulære matrix scaffolds, mens de stort set bevarer den native struktur af stilladset. Til dato er denne fremgangsmåde blevet anvendt i en række forskellige organsystemer, herunder hjerte, lunge og lever 1-5. Tidligere decellularization metoder for væv uden en let tilgængelig vaskulære netværk har påberåbt langvarig udsættelse af væv til opløsninger af vaske-og rengøringsmidler, syrer eller enzymatiske behandlinger som et middel til at fjerne de cellulære og nukleare komponenter fra det omgivende ekstracellulære miljø 6-8. Imidlertid effektiviteten af disse metoder hængslet af evnen af opløsningerne gennemtrænger vævet ved diffusion. I modsætning hertil effektivt perfusion af organer gennem naturlige vaskulære system reducerede diffusionsafstanden og lettet transport af decellularizatipå midler ind i vævet og cellulære komponenter ud af vævet. Heri, beskriver vi en fremgangsmåde til fuldt decellularize et intakt porcin hjerte gennem koronar retrograd perfusion. Protokollen gav et fuldt decellulariseret hjerte ekstracellulære matrix (c-ECM) stillads med den tredimensionale struktur af hjertet intakt. Vores metode en række enzymer, detergenter og syrer kombineret med hypertoniske og hypotonisk skylninger for at hjælpe med lysering og fjernelse af celler. Protokollen anvendt en trypsinopløsning at frigøre celler fra matrixen efterfulgt af Triton X-100 og natriumdeoxycholat opløsninger til hjælp ved fjernelse af cellemateriale. Den beskrevne protokol anvender også perfusion hastigheder på over 2 L / min i længere tid. Den høje strømningshastighed, kombineret med opløsning ændres tilladt transport af midler til vævet uden forurening af cellerester og sikret en effektiv skylning af vævet. Den beskrevne metode fjernede alt nukleart materiale fra Native porcint hjertevæv, hvilket skaber en stedspecifik hjerte ECM stillads, der kan anvendes til en lang række applikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den aktuelle undersøgelse beskrevne metode for en konsekvent og effektiv decellularization af et svin hjerte. Protokollen var en modifikation til en tidligere udgivet rapport 1, og omfattede længere udsættelse for flow og øget pres, som gav mere reproducerbare resultater. Den resulterende decellulariseret væv mødte alle de offentliggjorte kriterier for en vellykket decellularization af væv 2. Hyppige opløsning ændringer blev udført for at begrænse genindførelse af cellulært materiale t…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende Brogan Guest, Michelle Weaver, og Kristen Lippert. Finansieringen af denne undersøgelse blev leveret af NIH Grant R03EB009237 samt NIH uddannelsesstipendierne T32EB001026-06 fra National Institute of Biomedical Imaging And Bioengineering og T32HL076124-05.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Trypsin | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-500G | |
| Peracetic Acid | Pfaltz and Bauer | P05020 | 35% CAS# 79-21-0 |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex Pump Drive | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | 96400-18 | Size 18 |
| Barbed Reducer | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L Beaker | Fisher Scientific | 02-540T |
Referências
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. , (2008).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , (2010).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. , (2012).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).
- Weymann, A., et al. Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model–generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds. Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).
- Remlinger, N. T. Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction. Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).
- Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds. Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).
- Wainwright, J. M. Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold. Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).
