Prosedyre for Decellularization av svinekjøtt Heart av Retrograde Coronary Perfusjon
Summary
En metode til å raskt og fullstendig fjerne cellulære komponenter fra et intakt porcin hjertet gjennom retrograd perfusjon er beskrevet. Denne metode gir et stedsspesifikt kardial ekstracellulær matrix stillaset som har potensial for bruk i flere kliniske applikasjoner.
Abstract
Perfusjon-baserte hele organet decellularization har nylig fått interesse innen tissue engineering som et middel for å skape stedsspesifikke ekstracellulære matrix stillasene, mens stort sett bevare arkitekturens av stillaset. Til dags dato har denne tilnærmingen blitt utnyttet i en rekke organsystemer inkludert hjertet, lunge, og leveren 1-5. Tidligere decellularization metoder for vev uten en lett tilgjengelig vaskulære nettverk har stolt på langvarig eksponering av vev til løsninger av vaskemidler, syrer, eller enzymatiske behandlinger som et middel for å fjerne de cellulære og kjernefysiske komponenter fra den omkringliggende ekstracellulære miljøet 6-8. Imidlertid til effektiviteten av disse metodene hengslet av evnen av løsningene gjennomsyre vevet via diffusjon. I kontrast, perfusjon av organer gjennom naturlige karsystemet effektivt redusert diffusjon avstand og tilrettelagt transport av decellularizatipå agenter inn i vevet og cellulære komponenter ut av vevet. Heri, beskriver vi en metode for å fullt ut decellularize intakt svin hjertet gjennom koronar retrograd perfusjon. Protokollen ga et fullt decellularized kardial ekstracellulær matriks (c-ECM) stillaset med den tredimensjonale strukturen av hjertet intakt. Vår metode brukt en rekke enzymer, vaskemidler og syrer kombinert med hypertone og hypotonisk skyllinger til hjelp i lysis og fjerning av celler. Protokollen brukte en Trypsin løsning å løsne celler fra matrisen etterfulgt av Triton X-100 og natrium deoksycholat løsninger å bidra til å fjerne cellemateriale. Den beskrevne protokoll bruker også perfusjon hastigheter større enn 2 l / min i lengre perioder av gangen. Den høye strømningshastighet, kombinert med løsningen som er tillatt transport av agenter til vevet uten kontaminering av cellulært avfall og sikret effektiv skylling av vevet. Den beskrevne metoden fjernet alle kjernefysisk materiale fra Native svin hjertevev, skape en stedsspesifikk hjertestans ECM stillaset som kan brukes til en rekke bruksområder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nåværende studien beskrevet metodikk for konsistent og effektiv decellularization av en svin hjerte. Protokollen var en modifikasjon til en tidligere publisert rapport en, og inkludert lengre eksponering for strømning og økt trykk, som ga mer reproduserbare resultater. Den resulterende decellularized vev møtte alle de publiserte kriteriene for vellykket decellularization av vev 2. Hyppige løsning endringer ble utført for å begrense gjeninnføring av cellemateriale til vevet, og varighet…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Brogan Guest, Michelle Weaver, og Kristen Lippert. Midler til denne studien ble gitt av NIH R03EB009237 Grant, samt NIH Training Grants T32EB001026-06 fra National Institute of Biomedical Imaging og bioteknologi og T32HL076124-05.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Trypsin | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-500G | |
| Peracetic Acid | Pfaltz and Bauer | P05020 | 35% CAS# 79-21-0 |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex Pump Drive | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | 96400-18 | Size 18 |
| Barbed Reducer | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L Beaker | Fisher Scientific | 02-540T |
Referências
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. , (2008).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , (2010).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. , (2012).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).
- Weymann, A., et al. Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model–generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds. Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).
- Remlinger, N. T. Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction. Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).
- Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds. Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).
- Wainwright, J. M. Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold. Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).
