Um<em> In vivo</em> Ensaio para ensaio de permeabilidade dos vasos sangüíneos
Summary
Estamos apresentando um<em> In vivo</em> Ensaio para testar a permeabilidade dos vasos sanguíneos. Este ensaio baseia-se na injecção intravenosa de uma visualização do corante e subsequente da sua difusão para os espaços intersticiais.
Abstract
Este método baseia-se na injecção intravenosa de azul de Evans nos ratinhos como modelo animal de teste. Azul de Evans é um corante que se liga a albumina. Sob condições fisiológicas o endotélio é impermeável à albumina, de modo do azul de Evans encadernados restos de albumina restrito dentro dos vasos sanguíneos. Em condições patológicas que promovem o aumento da permeabilidade vascular células endoteliais parcialmente perder seus contatos próximos e com o endotélio torna-se permeável a pequenas proteínas, como a albumina. Esta condição permite o extravasamento de azul de Evans dos tecidos. Um endotélio saudável impede o extravasamento do corante nos tecidos vizinhos vascularizados. Órgãos com aumento da permeabilidade irá mostrar um aumento significativo em comparação com coloração azul órgãos com endotélio intacto. O nível de permeabilidade vascular pode ser avaliado por simples visualização ou por medição quantitativa do corante incorporado por miligrama de tecido de controlo versus animal experimental / tecido. Dois powerful aspectos deste ensaio são a simplicidade e características quantitativas. O Evans Blue, podem ser extraídos a partir de tecidos por incubação de uma quantidade específica de tecido em formamida. Evans Blue é a absorvância máxima a 620 nm e a absorvência é mínima a 740 nm. Utilizando uma curva padrão para o azul de Evans, medições da densidade óptica pode ser convertida em miligrama de corante capturado por miligrama de tecido. A análise estatística deve ser usado para avaliar diferenças significativas na permeabilidade vascular.
Introduction
Formação e manutenção de barreiras permeáveis selectivos são essenciais para o desenvolvimento do órgão apropriado e 1,2 desempenho. Linha de células endoteliais do lúmen do vaso sanguíneo e formar uma barreira semi-permeável, que é essencial para o transporte selectivo entre o sangue e o espaço intersticial de todos os órgãos. Uma barreira de permeabilidade adequada é mantida através apertados célula-a-célula junções que são estritamente controladas por factores de crescimento, citoquinas e moléculas de stress outros produtos 3. O rompimento da barreira de células endoteliais pode resultar em aumento da permeabilidade vascular e de fuga. Estes efeitos são observados em vários estados de doença e a compreensão da sinalização sublinhado molecular requer métodos multidisciplinares 4,5. Neste artigo, descreve um método in vivo para medir a permeabilidade vascular utilizando um modelo de rato.
O ensaio que se descreve, também conhecido como ensaio de Miles, é uma bem establtada método para testar a permeabilidade vascular in vivo. O ensaio baseia-se no facto de que, sob condições fisiológicas basais, a albumina não atravessa a barreira endotelial. Azul de Evans, um corante azóico com elevada afinidade para a albumina, é injectado na corrente sanguínea de um animal experimental e, sob condições fisiológicas, é esperado para ser restringida dentro dos vasos sanguíneos. Quando um estímulo permeabilidade vascular é adicionado, quer por aplicação tópica ou sistemicamente, os vasos sanguíneos começar a vazar proteína e, assim, também o azul de Evans, que se liga à albumina. Isto resulta numa coloração rápida azulada dos tecidos que têm vasos permeáveis.
Injecção com êxito do corante na veia da cauda do rato lateral é crítica para o bom resultado do experimento. Técnica de injecção da veia da cauda requer prática extensiva e deverá ser dominadas antes de se iniciar a experiência.
Permeabilidade vascular é altamente dependente da idade e do peso do umImal, então quando comparando diferentes linhagens de camundongos, é imperativo que os ratos ou outros assuntos de teste têm perto de datas de nascimento e peso idênticos. Outros factores que influenciam a permeabilidade da barreira endotelial são condições ambientais, tais como temperatura, humidade, e muito importante, o stress manuseamento do rato. Devido ao grande número de fatores que podem influenciar o resultado do experimento, é sempre aconselhável que o experimento é repetido pelo menos três vezes e análise estatística realizada.
Este ensaio pode ser utilizado para comparar a permeabilidade ou vaso de ratos que foram geneticamente modificadas, bem como os ratos com diferentes antecedentes genéticos. A permeabilidade pode ser determinada na presença ou na ausência de um estímulo, dependendo da função do gene, que é modulada. Este ensaio também pode ser usado ou para testar o efeito de diferentes compostos sobre a permeabilidade do vaso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Permeabilidade vascular é um marcador para o estado fundamental do vaso sanguíneo. Aumento da permeabilidade vascular tem mostrado estar presente em várias doenças sistémicas, incluindo a diabetes, a hipertensão, e doenças auto-imunes 6,7,8. Aumento da permeabilidade vascular tem sido mostrado para ser mediada por tensão de corte, os factores de crescimento tais como o factor de crescimento endotelial vascular e factor de crescimento de fibroblastos, os mediadores inflamatórios tais como histamina, s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por uma doação do Instituto Nacional de Saúde, R01CA142928.
Materials
| REAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4 |
||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE RESTRAINT DEVICE | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| SYRINGE | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | The gauge of the needle depends on the size of the animal. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 |
Referências
- Beck, K. F., et al. Inducible NO synthase: role in cellular signaling. J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).
- Bertglia, S., Giusti, A. Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).
- Miles, A. A., Miles, E. M. Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs. J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).
- Weis, S. M. Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer. Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).
- Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation. Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).
- Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).
- Scheppke, ., et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).
- Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability. J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).
- Dvorak, A. M. Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle. Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).
- Le Guelte, A., Gavard, J. Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability. Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human “endothelium”. Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).
