Un<em> In vivo</em> Ensayo de prueba de permeabilidad Vasos Sanguíneos
Summary
Estamos presentando un<em> In vivo</em> Ensayo para probar la permeabilidad de los vasos sanguíneos. Este ensayo se basa en la inyección intravenosa de un colorante y la posterior visualización de su difusión en espacios intersticiales.
Abstract
Este método se basa en la inyección intravenosa de azul de Evans en ratones como modelo animal de ensayo. El azul de Evans es un colorante que se une a la albúmina. En condiciones fisiológicas el endotelio es impermeable a la albúmina, por lo azul de Evans albúmina permanece unido restringidos dentro de los vasos sanguíneos. En condiciones patológicas que promueven el aumento de la permeabilidad células endoteliales vasculares pierden parcialmente sus contactos estrechos y el endotelio se vuelve permeable a pequeñas proteínas tales como albúmina. Esta condición permite la extravasación de azul de Evans en los tejidos. Un endotelio sano previene la extravasación del colorante en los tejidos vascularizados vecinos. Los órganos con aumento de la permeabilidad mostrará coloración azul aumentó significativamente en comparación con los órganos con endotelio intacto. El nivel de permeabilidad vascular se puede evaluar por simple visualización o por medición cuantitativa del colorante incorporado por miligramo de tejido de control versus animal experimental / tejido. Dos Powerful aspectos de este ensayo son su simplicidad y características cuantitativas. Colorante azul de Evans se puede extraer de los tejidos mediante la incubación de una cantidad específica de tejido en formamida. Evans Blue es el máximo de absorción a 620 nm y la absorbancia es mínimo a 740 nm. Mediante el uso de una curva estándar para el azul de Evans, medidas de densidad óptica se puede convertir en colorante capturado miligramo por miligramo de tejido. El análisis estadístico se debe utilizar para evaluar las diferencias significativas en la permeabilidad vascular.
Introduction
Formación y mantenimiento de barreras permeables selectivas son esenciales para el desarrollo adecuado de los órganos y 1,2 rendimiento. Las células endoteliales recubren el lumen del vaso sanguíneo y forman una barrera semi-permeable que es esencial en el transporte selectivo entre la sangre y el espacio intersticial de todos los órganos. Una barrera de permeabilidad adecuada se mantiene a través de estrechos célula a célula uniones que están estrictamente controladas por factores de crecimiento, citoquinas y otras moléculas relacionadas con el estrés 3. La interrupción de la barrera de células endoteliales puede resultar en aumento de la permeabilidad vascular y las fugas. Estos efectos se observan en diversos estados de enfermedad y la comprensión de la señalización molecular subrayado requiere métodos multidisciplinarios 4,5. En este artículo, se describe un método in vivo para medir la permeabilidad de los vasos utilizando un modelo de ratón.
El ensayo que se describe, también conocido como ensayo de Miles, es un bien establISHED método para probar la permeabilidad vascular in vivo. El ensayo se basa en el hecho de que, bajo condiciones fisiológicas basales, la albúmina no cruza la barrera endotelial. Evans Blue, un colorante azoico con alta afinidad para la albúmina, se inyecta en la corriente sanguínea de un animal experimental, y bajo condiciones fisiológicas, se espera a ser restringido dentro de los vasos sanguíneos. Cuando un estímulo permeabilidad vascular se añade, ya sea tópica o sistémica, los vasos sanguíneos comienzan a gotear proteína y, por tanto, también el azul de Evans que se une a la albúmina. Esto resulta en una coloración azulada rápida de los tejidos que tienen vasos permeables.
Inyección exitosa del colorante en la vena lateral de la cola del ratón es crítica para el buen resultado del experimento. Vena de la cola técnica de inyección requiere una amplia práctica y debe ser dominado antes de iniciar el experimento.
Permeabilidad de los vasos es altamente dependiente de la edad y el peso de la unaimal, por lo que cuando se comparan diferentes cepas de ratón, es imperativo que los ratones u otros sujetos de prueba tienen cerca de las fechas de nacimiento y el peso idénticas. Otros factores que influyen en la permeabilidad de la barrera endotelial son las condiciones ambientales tales como temperatura, humedad, y muy importante, el estrés del manejo del ratón. Debido a la multitud de factores que pueden influir en el resultado del experimento es siempre aconsejable que el experimento se repitió al menos tres veces y el análisis estadístico realizado.
Este ensayo puede ser utilizado para comparar o permeabilidad de los vasos de ratones que han sido modificadas genéticamente, así como los ratones con diferentes fondos genéticos. La permeabilidad puede ser evaluada en presencia o ausencia de un estímulo, dependiendo de la función del gen que se modula. Este ensayo también se puede usar o para probar el efecto de diferentes compuestos sobre la permeabilidad de los vasos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La permeabilidad vascular es un marcador crítico para el estado de los vasos sanguíneos. Aumento de la permeabilidad vascular se ha demostrado que está presente en varias enfermedades sistémicas, incluyendo la diabetes, la hipertensión y las enfermedades autoinmunes 6,7,8. Aumento de la permeabilidad vascular ha demostrado ser mediada por esfuerzo cortante, factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento endotelial vascular y el factor de crecimiento de fibroblastos, mediadores de la inflamac…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud, R01CA142928.
Materials
| REAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4 |
||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE RESTRAINT DEVICE | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| SYRINGE | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | The gauge of the needle depends on the size of the animal. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 |
Referências
- Beck, K. F., et al. Inducible NO synthase: role in cellular signaling. J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).
- Bertglia, S., Giusti, A. Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).
- Miles, A. A., Miles, E. M. Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs. J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).
- Weis, S. M. Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer. Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).
- Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation. Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).
- Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).
- Scheppke, ., et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).
- Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability. J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).
- Dvorak, A. M. Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle. Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).
- Le Guelte, A., Gavard, J. Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability. Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human “endothelium”. Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).
