在哺乳动物细胞中的内质网定位的mRNA的可视化
Summary
在这里，我们描述了一种方法，可视化在哺乳动物组织培养细胞的内质网相关的mRNA。这项技术涉及的质膜的选择性通透性毛地黄皂苷以除去细胞质随后通过荧光的内容<em在原位</em杂交技术检测无论是散装的poly（A）mRNA的转录。
Abstract
在真核生物中，大多数的信使RNA（mRNA），编码分泌蛋白和膜蛋白定位于内质网（ER）的表面。然而，这些mRNA的可视化可以是具有挑战性。这是特别真实的mRNA时，只有一小部分是内质网相关和非锁定目标（ 即 “免费”）成绩单阻碍该细胞器，它们的分布。为了监测ER-相关的mRNA，我们已经开发了一种方法，在该方法中，细胞被视为一个毛地黄皂苷萃取溶液，选择性permeabilizes质膜与短曝光，从而除去细胞质内容，同时保持该ER的完整性。再加上荧光原位杂交（FISH）此方法时，人们可以清楚地在荧光显微镜下观察雌激素受体 结合的基因。使用该协议ER关联的程度，无论是散装的poly（A）成绩单或特定的基因可以评估甚至是量化的。在这个过程中，人们可以使用该测定调查的mRNA-雌激素受体的相互作用的性质。
Introduction
在真核生物中，mRNA编码分泌蛋白和膜蛋白可以有针对性地合作翻译ER信号识别颗粒1,2和可维持的ER通过直接翻译核糖体和translocons在3,4之间的相互作用。然而，无论是基因ER独立的核糖体或翻译时，可以有针对性和维护不清楚，直到最近。以往的研究试图解决翻译是否有独立的表达与ER使用细胞分离技术。因为要求苛刻的化学条件，以解除核糖体ER衍生的囊泡，它可能会破坏潜在的微妙的表达ER协会，这些研究没有定论，提供的证据5-8，对9,10锚定的mRNA的核糖体独立的ER 。
为了避免这些问题，我们已经开发出一种原山坳隔离和图像雌激素受体结合的基因。此过程涉及到一个温和的提取处理，从而有效地消除所有（包括非雌激素受体结合的基因）的细胞的细胞质内容，同时保留内质网的形态和其相关的分子。使用这个协议中，我们已经证明，一个子集的mRNAs的目标，然后保持在ER的核糖体或翻译11独立。
Protocol
Representative Results
Discussion
不同的亚细胞位点的基因定位，通过转录本mRNA的定位蛋白的相互作用，是一种普遍现象的正确排序的蛋白质，以他们的最终目的地，微调基因表达的亚细胞地方规定区19,20。
使用此处所描述的测定，我们重新编码分泌蛋白的mRNA的是否可以保持在ER中的或翻译的核糖体的存在或不存在的问题的。事实上，我们发现，这些基因的一个子集，有这样的活动11。例如?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是支持的补助金从国家科学与工程研究理事会，加拿大，西飞和AFP
Referências
- Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).
- Walter, P., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).
- Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation. Cell. 71, 489-503 (1992).
- Grlich, D., Rapoport, T. A. Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane. Cell. 75, 615-630 (1993).
- Milcarek, C., Penman, S. Membrane-bound polyribosomes in HeLa cells: association of polyadenylic acid with membranes. J. Mol. Biol. 89, 327-338 (1974).
- Lande, M. A., Adesnik, M., Sumida, M., Tashiro, Y., Sabatini, D. D. Direct association of messenger RNA with microsomal membranes in human diploid fibroblasts. J. Cell Biol. 65, 513-528 (1975).
- Cardelli, J., Long, B., Pitot, H. C. Direct association of messenger RNA labeled in the presence of fluoroorotate with membranes of the endoplasmic reticulum in rat liver. J. Cell Biol. 70, 47-58 (1976).
- Adesnik, M., Lande, M., Martin, T., Sabatini, D. D. Retention of mRNA on the endoplasmic reticulum membranes after in vivo disassembly of polysomes by an inhibitor of initiation. J. Cell Biol. 71, 307-313 (1976).
- Kruppa, J., Sabatini, D. D. Release of poly A(+) messenger RNA from rat liver rough microsomes upon disassembly of bound polysomes. J. Cell Biol. 74, 414-427 (1977).
- Adesnik, M., Maschio, F. Segregation of specific classes of messenger RNA into free and membrane-bound polysomes. Eur. J. Biochem. 114, 271-284 (1981).
- Cui, X. A., Zhang, H., Palazzo, A. F. p180 Promotes the Ribosome-Independent Localization of a Subset of mRNA to the Endoplasmic Reticulum. PLoS Biol. 10, e1001336 (2012).
- Pestka, S. Inhibitors of ribosome functions. Annu. Rev. Microbiol. 25, 487-562 (1971).
- Fresno, M., Jimnez, A., Vzquez, D. Inhibition of translation in eukaryotic systems by harringtonine. Eur. J. Biochem. 72, 323-330 (1977).
- Weeks, D. P., Baxter, R. Specific inhibition of peptide-chain initiation by 2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide. Bioquímica. 11, 3060-3064 (1972).
- Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes. Cell. 147, 789-802 (2011).
- Lerner, R. S., et al. Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes. RNA. 9, 1123-1137 (2003).
- Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors. J. Cell Biol. 111, 807-816 (1990).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
- Lcuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
- Lcuyer, E., Yoshida, H., Krause, H. M. Global implications of mRNA localization pathways in cellular organization. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 409-415 (2009).
- Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. Analysis of mRNA nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection. J Vis Exp. 46, e2387 (2010).
