ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים
Summary
כאן אנו מתארים שיטה לדמיין mRNAs endoplasmic reticulum הקשורים בתאי תרבית רקמת יונקים. טכניקה זו כרוכה permeabilization סלקטיבית של קרום הפלזמה עם digitonin להסיר תוכן cytoplasmic אחרי הניאון<em> באתר</em> הכלאה לזהות או פולי תפזורת () mRNA או תעתיקים ספציפיים.
Abstract
באאוקריוטים, רוב RNAs השליח (mRNAs) המקודדים מופרשת והחלבונים בממברנה מותאמת לשפה מקומיים על פני השטח של reticulum endoplasmic (ER). עם זאת, להדמיה של mRNAs אלה יכול להיות מאתגרות. זה נכון במיוחד כאשר רק חלק קטן מן mRNA הוא ER-משויך והפצתם לאברון זה הנה חסום על ידי תמלילים שאינם ממוקדים (כלומר "חופשי"). על מנת לפקח mRNAs ER-נלווה, פתח שיטה שבה תאי מטופלים עם חשיפה קצרה לפתרון חילוץ digitonin כי סלקטיבי permeabilizes קרום הפלזמה, ובכך מסיר את תוכן cytoplasmic, תוך שמירה על שלמות ER . כאשר שיטה זו היא בשילוב עם ניאון כלאה באתר (FISH), אפשר לחזות באופן ברור mRNAs ER-כפות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. באמצעות פרוטוקול זה המידה של ER-עמותה לאו תעתיקי תפזורת פולי () או mRNAs הספציפי ניתן להעריךואפילו לכימות. בתהליך, אפשר להשתמש בבדיקה זו כדי לחקור את טבעו של אינטראקציות mRNA-ER.
Introduction
באאוקריוטים, קידוד ה-mRNA מופרש וחלבוני קרום יכולים להיות ממוקדים לחדר מיון השיתוף translationally ידי 1,2 חלקיק הכרת האות ואפשר לקיים ER דרך האינטראקציות הישירות בין הריבוזומים וtranslocons במהלך תרגום 3,4. עם זאת, האם יכול להיות ממוקד mRNAs ומתוחזק על ER העצמאי או הריבוזומים או תרגום לא היה ברור עד לאחרונה. מחקרים קודמים ניסו לענות האם יש קשר תרגום עצמאי mRNA עם ER באמצעות טכניקות חלוקה תאיות. בגלל תנאים כימיים קשים נדרשו לנתק את הריבוזומים משלפוחית ER נגזר, שעשוי לשבש את ה-mRNA-ER העדינה פוטנציאלי העמותה, מחקרים אלה לא היו חד משמעיים, הוכחה ל5-8 ונגד 9,10 עיגון ריבוזומלי עצמאי של mRNA לחדר המיון .
כדי להתגבר על בעיות אלו פתחנו פרוטוcol לבודד ותמונה mRNAs ER-כפות. הליך זה כרוך טיפול חילוץ קל, שמסיר ביעילות את כל תוכן cytoplasmic של התא (כולל mRNAs אינו ER-כפות) תוך שמירה על מורפולוגיה ER וכל המולקולות הקשורים אליו. באמצעות פרוטוקול זה אנו מראים כי קבוצת משנה של mRNAs ממוקדות ולאחר מכן שמרה על חדר המיון באופן עצמאי או תרגום של הריבוזומים 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
הלוקליזציה של mRNAs לאתרי subcellular שונים, באמצעות האינטראקציה של תמלילים עם חלבוני לוקליזציה mRNA, היא תופעה נפוצה חשובה למיון הנכון של חלבונים ליעד הסופי שלהם, ולכוונון העדין של ביטוי גנים לדרישות המקומיות של subcellular אזור 19,20.
באמ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהלאומיים למדע והנדסת מועצת המחקר של קנדה לXAC וAFP
Referências
- Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).
- Walter, P., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).
- Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation. Cell. 71, 489-503 (1992).
- Grlich, D., Rapoport, T. A. Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane. Cell. 75, 615-630 (1993).
- Milcarek, C., Penman, S. Membrane-bound polyribosomes in HeLa cells: association of polyadenylic acid with membranes. J. Mol. Biol. 89, 327-338 (1974).
- Lande, M. A., Adesnik, M., Sumida, M., Tashiro, Y., Sabatini, D. D. Direct association of messenger RNA with microsomal membranes in human diploid fibroblasts. J. Cell Biol. 65, 513-528 (1975).
- Cardelli, J., Long, B., Pitot, H. C. Direct association of messenger RNA labeled in the presence of fluoroorotate with membranes of the endoplasmic reticulum in rat liver. J. Cell Biol. 70, 47-58 (1976).
- Adesnik, M., Lande, M., Martin, T., Sabatini, D. D. Retention of mRNA on the endoplasmic reticulum membranes after in vivo disassembly of polysomes by an inhibitor of initiation. J. Cell Biol. 71, 307-313 (1976).
- Kruppa, J., Sabatini, D. D. Release of poly A(+) messenger RNA from rat liver rough microsomes upon disassembly of bound polysomes. J. Cell Biol. 74, 414-427 (1977).
- Adesnik, M., Maschio, F. Segregation of specific classes of messenger RNA into free and membrane-bound polysomes. Eur. J. Biochem. 114, 271-284 (1981).
- Cui, X. A., Zhang, H., Palazzo, A. F. p180 Promotes the Ribosome-Independent Localization of a Subset of mRNA to the Endoplasmic Reticulum. PLoS Biol. 10, e1001336 (2012).
- Pestka, S. Inhibitors of ribosome functions. Annu. Rev. Microbiol. 25, 487-562 (1971).
- Fresno, M., Jimnez, A., Vzquez, D. Inhibition of translation in eukaryotic systems by harringtonine. Eur. J. Biochem. 72, 323-330 (1977).
- Weeks, D. P., Baxter, R. Specific inhibition of peptide-chain initiation by 2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide. Bioquímica. 11, 3060-3064 (1972).
- Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes. Cell. 147, 789-802 (2011).
- Lerner, R. S., et al. Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes. RNA. 9, 1123-1137 (2003).
- Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors. J. Cell Biol. 111, 807-816 (1990).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
- Lcuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
- Lcuyer, E., Yoshida, H., Krause, H. M. Global implications of mRNA localization pathways in cellular organization. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 409-415 (2009).
- Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. Analysis of mRNA nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection. J Vis Exp. 46, e2387 (2010).
