Visualização de mRNAs retículo endoplasmático localizados em células de mamíferos
Summary
Descrevemos aqui um método para visualizar retículo endoplasmático associadas mRNAs em células de cultura de mamífero de tecidos. Esta técnica envolve a permeabilização selectiva da membrana plasmática com digitonina para remover conteúdo citoplasmático seguido fluorescente<em> In situ</em> Hibridação para detectar ou poli granel (A) mRNA ou transcritos específicos.
Abstract
Nos eucariotas, a maioria dos RNAs mensageiros (mRNAs), que codificam proteínas de membrana e segregadas são localizados na superfície do retículo endoplasmático (ER). No entanto, a visualização destes mRNAs pode ser um desafio. Isto é especialmente verdadeiro quando apenas uma fracção do mRNA é ER-associado e a sua distribuição a esta organela é obstruída por não-segmentados (isto é, "livre") transcrições. A fim de controlar ER-associados mRNAs, foi desenvolvido um método no qual as células são tratadas com uma exposição de curta duração a uma solução de extracção que digitonina permeabilizes selectivamente a membrana do plasma e, portanto, remove o conteúdo citoplasmático, mantendo simultaneamente a integridade do ER . Quando este método é acoplado com hibridação in situ fluorescente (FISH), pode-se visualizar claramente ER-bound mRNAs por microscopia de fluorescência. Usando este protocolo o grau de ER-associação, quer para a granel de poli (A) ou transcritos de ARNm específicos podem ser avaliadose ainda quantificado. No processo, pode-se utilizar este teste para investigar a natureza do mRNA do ER-interacções.
Introduction
Nos eucariotas, a codificação de mRNA e proteínas da membrana secretada pode ser orientada para o ER por co-tradução do sinal de reconhecimento 1,2 partícula e pode ser mantido no ER via das interacções directas entre os ribossomas e translocons durante a tradução 3,4. No entanto, se mRNAs podem ser direcionados e mantido na ER independente de ou ribossomos ou a tradução não estava claro até muito recentemente. Estudos anteriores tentaram abordar se há tradução independente de associação com o mRNA ER utilizando técnicas de fraccionamento celular. Como as condições químicas severas eram necessárias para desassociar ribossomos de ER vesículas derivados, que podem interromper o potencialmente delicado mRNA-ER associação, esses estudos não foram conclusivos, fornecendo provas para 5-8 e contra 9,10 ribossomal independente de ancoragem de mRNA para o pronto-socorro .
Para contornar estes problemas, desenvolvemos um protocol para isolar e imagem ER ligados mRNAs. Este procedimento envolve um tratamento de extracção suave, que remove eficazmente todo o conteúdo citoplasmático da célula (incluindo os não-ligado ER mRNAs), ao mesmo tempo preservando a morfologia ER e todas as suas moléculas associadas. Usando este protocolo, demonstramos que um subconjunto de mRNAs são orientados e, em seguida, mantido na ER independentemente de ribossomas ou de tradução 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
A localização dos mRNAs para vários locais subcelulares, através da interacção com proteínas de transcritos de mRNA de localização, é um fenómeno generalizado importante para a triagem adequada de proteínas para o seu destino final, e para o ajuste fino da expressão de genes com os requisitos locais de uma subcelular região 19,20.
Utilizando o ensaio aqui descrito, revisitamos a questão de se os ARNm que codificam para proteínas de secreção pode ser mantida no ER…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por doações do Nacional de Ciência e Pesquisa de Engenharia Council of Canada para XAC e AFP
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