Визуализация эндоплазматического ретикулума Локализованные мРНК в клетках млекопитающих
Summary
Здесь мы опишем метод визуализации эндоплазматическая сеть связанных мРНК в клетках млекопитающих культуре ткани. Эта методика включает в себя селективный проницаемости плазмы мембраны с дигитонина удалить цитоплазматического содержимого последующим флуоресцентным<em> На месте</em> Гибридизации для выявления объемных или поли (А) мРНК или конкретных стенограммы.
Abstract
У эукариот, большинство из РНК, (мРНК), которая кодирует выделяется и мембранные белки локализованы на поверхности эндоплазматической сети (ER). Тем не менее, визуализации этих мРНК может быть сложной задачей. Это особенно верно, когда только часть мРНК ER-ассоциированных и их распределение этой органеллы затруднен нецелевой (т.е. "свободный") стенограмм. В целях контроля ER-связанных мРНК, мы разработали метод, при котором клетки обрабатывают с коротким воздействием решение дигитонина добычи, избирательно permeabilizes плазматической мембраны, и таким образом снимает цитоплазматического содержимого, при одновременном сохранении целостности ER . Когда этот метод в сочетании с флуоресцентной гибридизации (FISH), можно четко визуализировать ER-связанного мРНК методом флуоресцентной микроскопии. С помощью этого протокола степени ER-ассоциации либо объемных поли (А) транскриптов или конкретных мРНК может быть оцененаи даже количественно. В этом процессе можно использовать этот анализ для исследования природы мРНК-ER взаимодействия.
Introduction
У эукариот мРНК, кодирующей выделяется и мембранных белков могут быть направлены на ER совместно трансляционно частицей 1,2 признание сигнала и может быть сохранен на ER через прямое взаимодействие между рибосомами и translocons во время перевода 3,4. Однако, независимо от мРНК могут быть направлены и поддерживается на ER зависит ни от рибосомы или перевода была неясна до самого последнего времени. Предыдущие исследования пытаются решить, есть ли перевод независимой мРНК связи с использованием ER сотовой методы фракционирования. Из-за суровых условиях химического должны были отделиться от рибосомы ER, полученных пузырьков, которые могут нарушить тонкий потенциально мРНК-ER ассоциации, эти исследования не дали результатов, что свидетельствует в течение 5-8 и против 9,10 рибосомных независимых закрепления мРНК ER .
Чтобы обойти эти проблемы мы разработали протоцв, чтобы изолировать и изображения ER-связанного мРНК. Эта процедура включает в себя мягкий лечения добычи, которая эффективно удаляет все цитоплазматического содержимого ячейки (в том числе не связанных ER-мРНК) при одновременном сохранении ER морфологии и все связанные с ней молекулы. С помощью этого протокола мы продемонстрировали, что подмножество мРНК ориентированы, а затем поддерживается на ER независимо от рибосомы или перевод 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Локализация мРНК в различных субклеточных сайтов, через взаимодействие с белками стенограммы мРНК локализации, является широко распространенным явлением важна для правильной сортировки белков в конечный пункт назначения, а также для тонкой настройки экспрессии генов в местные треб?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от Национального научного и инженерного исследовательского совета Канады XAC и AFP
Referências
- Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).
- Walter, P., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).
- Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation. Cell. 71, 489-503 (1992).
- Grlich, D., Rapoport, T. A. Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane. Cell. 75, 615-630 (1993).
- Milcarek, C., Penman, S. Membrane-bound polyribosomes in HeLa cells: association of polyadenylic acid with membranes. J. Mol. Biol. 89, 327-338 (1974).
- Lande, M. A., Adesnik, M., Sumida, M., Tashiro, Y., Sabatini, D. D. Direct association of messenger RNA with microsomal membranes in human diploid fibroblasts. J. Cell Biol. 65, 513-528 (1975).
- Cardelli, J., Long, B., Pitot, H. C. Direct association of messenger RNA labeled in the presence of fluoroorotate with membranes of the endoplasmic reticulum in rat liver. J. Cell Biol. 70, 47-58 (1976).
- Adesnik, M., Lande, M., Martin, T., Sabatini, D. D. Retention of mRNA on the endoplasmic reticulum membranes after in vivo disassembly of polysomes by an inhibitor of initiation. J. Cell Biol. 71, 307-313 (1976).
- Kruppa, J., Sabatini, D. D. Release of poly A(+) messenger RNA from rat liver rough microsomes upon disassembly of bound polysomes. J. Cell Biol. 74, 414-427 (1977).
- Adesnik, M., Maschio, F. Segregation of specific classes of messenger RNA into free and membrane-bound polysomes. Eur. J. Biochem. 114, 271-284 (1981).
- Cui, X. A., Zhang, H., Palazzo, A. F. p180 Promotes the Ribosome-Independent Localization of a Subset of mRNA to the Endoplasmic Reticulum. PLoS Biol. 10, e1001336 (2012).
- Pestka, S. Inhibitors of ribosome functions. Annu. Rev. Microbiol. 25, 487-562 (1971).
- Fresno, M., Jimnez, A., Vzquez, D. Inhibition of translation in eukaryotic systems by harringtonine. Eur. J. Biochem. 72, 323-330 (1977).
- Weeks, D. P., Baxter, R. Specific inhibition of peptide-chain initiation by 2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide. Bioquímica. 11, 3060-3064 (1972).
- Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes. Cell. 147, 789-802 (2011).
- Lerner, R. S., et al. Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes. RNA. 9, 1123-1137 (2003).
- Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors. J. Cell Biol. 111, 807-816 (1990).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
- Lcuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
- Lcuyer, E., Yoshida, H., Krause, H. M. Global implications of mRNA localization pathways in cellular organization. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 409-415 (2009).
- Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. Analysis of mRNA nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection. J Vis Exp. 46, e2387 (2010).
