Memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mRNA'ların görselleştirilmesi
Summary
Burada memeli doku kültürü hücrelerinde endoplazmik retikulum ilişkili mRNA'ların görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, floresan, ardından sitoplazmik boşaltılmaya digitonin ile birlikte plazma zarının geçirgenliği seçici içerir<em> In situ</emYa da yığın poli (A) ya da spesifik mRNA transkriptleri tespit etmek için> melezleme.
Abstract
Ökaryotlarda salgılanan ve membran proteinleri endoplazmik retikulum (ER) yüzeyine lokalizedir kodlamak haberci RNA'lar (mRNA) çoğu. Bununla birlikte, bu mRNA'ların görselleştirme zor olabilir. Bu mRNA yalnızca bir kısmını ER ilişkili olduğunda özellikle doğrudur ve bu organel kendi dağıtım olmayan hedefli (yani "özgür") transkript tarafından engelleniyor. Aynı anda ER bütünlüğünü korurken ER-ilişkili mRNA izlemek için, biz, hücreler seçici olarak plazma zarının bir permeabilizes digitonin ekstraksiyon çözeltisi için kısa bir maruz kalma ile muamele edildiği bir yöntem geliştirilmiştir ve bu nedenle sitoplazmik içeriğini kaldırır adres . Bu yöntem in situ hibridizasyon (FISH) flüoresan ile birleştiğinde, biri açıkça floresan mikroskobu ile ER-bound mRNA'ların oluşturulabiliyor. Bu protokol kullanılarak yığın poli (A) ya da spesifik mRNA transkriptleri için ya da ER-bağlantının derecesini tespit edilebilirve hatta sayılabilir. Bu süreç içinde bir mRNA ER etkileşimlerinin doğası araştırmak için bu testte kullanılabilir.
Introduction
Ökaryotlarda mRNA kodlama çeviri 3,4 sırasında ribozomlar ve translocons arasındaki doğrudan etkileşim yoluyla salgılanan ve membran proteinlerinin eş Çevrimsel sinyal tanıma parçacık 1,2 ER hedeflenebilir ve ER korunabilir. Ancak, mRNA hedefli ve ribozomlar veya çeviri birinin ER bağımsız üzerinde muhafaza edilip edilemeyeceğini çok yakın zamanlara kadar belli değildi. Önceki çalışmalar hücresel fraksiyonlama teknikleri kullanılarak ER ile çeviri bağımsız mRNA ilişki olup olmadığını değinmeye çalıştık. Sert kimyasal koşulların potansiyel hassas mRNA-ER dernek kesebileceği ER türetilmiş veziküller, ribozomların kesmek için gerekli olduğu için, bu çalışmalarda 5-8 delil sağlayan, sonuçsuz ve 9,10 karşı ribozomal bağımsız mRNA ER ankraj .
Bu sorunları aşmak için bir proto geliştirdikcol yalıtmak ve görüntü ER bağlı mRNA'ların için. Bu prosedür, aynı anda ER morfoloji ve ilişkili moleküllerin tüm koruyarak etkin bir şekilde hücre (ER-bağlı olmayan mRNA dahil), tüm içerik sitoplazmik kaldıran bir hafif çıkarma tedavi, içerir. Bu protokolü kullanarak biz mRNA'ların bir alt hedef ve sonra bağımsız ribozomlar veya çeviri 11 ER muhafaza olduğunu göstermiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çeşitli Subselüler sitelere mRNA'ların lokalizasyonu, mRNA localisation proteinler ile transkript etkileşimi aracılığıyla, bir hücre içi ve yerel gereksinimler nihai hedefe proteinlerin doğru sıralama için ve gen ekspresyonu ince ayar için önemli bir yaygın bir olgudur bölge 19,20.
Tahlil kullanılarak burada açıklandığı gibi, bu salgı proteinleri kodlayan mRNA ribozom ya da çeviri varlığında veya yokluğunda, ER muhafaza edilebilir olup olmadığı…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma XAC ve AFP Ulusal Bilim ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi bağışları ile desteklenmiştir
Referências
- Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).
- Walter, P., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).
- Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation. Cell. 71, 489-503 (1992).
- Grlich, D., Rapoport, T. A. Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane. Cell. 75, 615-630 (1993).
- Milcarek, C., Penman, S. Membrane-bound polyribosomes in HeLa cells: association of polyadenylic acid with membranes. J. Mol. Biol. 89, 327-338 (1974).
- Lande, M. A., Adesnik, M., Sumida, M., Tashiro, Y., Sabatini, D. D. Direct association of messenger RNA with microsomal membranes in human diploid fibroblasts. J. Cell Biol. 65, 513-528 (1975).
- Cardelli, J., Long, B., Pitot, H. C. Direct association of messenger RNA labeled in the presence of fluoroorotate with membranes of the endoplasmic reticulum in rat liver. J. Cell Biol. 70, 47-58 (1976).
- Adesnik, M., Lande, M., Martin, T., Sabatini, D. D. Retention of mRNA on the endoplasmic reticulum membranes after in vivo disassembly of polysomes by an inhibitor of initiation. J. Cell Biol. 71, 307-313 (1976).
- Kruppa, J., Sabatini, D. D. Release of poly A(+) messenger RNA from rat liver rough microsomes upon disassembly of bound polysomes. J. Cell Biol. 74, 414-427 (1977).
- Adesnik, M., Maschio, F. Segregation of specific classes of messenger RNA into free and membrane-bound polysomes. Eur. J. Biochem. 114, 271-284 (1981).
- Cui, X. A., Zhang, H., Palazzo, A. F. p180 Promotes the Ribosome-Independent Localization of a Subset of mRNA to the Endoplasmic Reticulum. PLoS Biol. 10, e1001336 (2012).
- Pestka, S. Inhibitors of ribosome functions. Annu. Rev. Microbiol. 25, 487-562 (1971).
- Fresno, M., Jimnez, A., Vzquez, D. Inhibition of translation in eukaryotic systems by harringtonine. Eur. J. Biochem. 72, 323-330 (1977).
- Weeks, D. P., Baxter, R. Specific inhibition of peptide-chain initiation by 2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide. Bioquímica. 11, 3060-3064 (1972).
- Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes. Cell. 147, 789-802 (2011).
- Lerner, R. S., et al. Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes. RNA. 9, 1123-1137 (2003).
- Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors. J. Cell Biol. 111, 807-816 (1990).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
- Lcuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
- Lcuyer, E., Yoshida, H., Krause, H. M. Global implications of mRNA localization pathways in cellular organization. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 409-415 (2009).
- Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. Analysis of mRNA nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection. J Vis Exp. 46, e2387 (2010).
