Måling af Levetid i<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Drosophila melanogaster er en kraftfuld model organisme for at udforske den molekylære basis for levetiden regulering. Denne protokol vil diskutere de skridt, der er involveret i at generere en reproducerbar, befolkning-baseret måling af levetiden samt potentielle faldgruber og hvordan man undgår dem.
Abstract
Aldring er et fænomen, der resulterer i steady fysiologiske forringelse af næsten alle organismer i hvilke det er blevet undersøgt, hvilket fører til nedsat fysisk ydeevne og øget risiko for sygdom. Individuel aldring er åbenbart på populationsniveau som en stigning i aldersafhængig dødelighed, som ofte måles i laboratoriet ved at observere levetid i store kohorter af aldersmatchede individer. Eksperimenter, der søger at kvantificere det omfang, hvori genetiske eller miljømæssige manipulationer indvirkning levetid i simple model organismer har været bemærkelsesværdigt vellykkede til forståelse af aspekter ved aldring, som er konserveret på tværs af enheder samt for inspirerende nye strategier til at udvide levetiden og forhindre aldersbetinget sygdom hos pattedyr .
Den eddike flyve, Drosophila melanogaster, er en attraktiv model organisme for at studere de mekanismer af aldring på grund af sin relativt korte levetid, praktisk dyrehold, og letkøbte genetik.Men demografiske foranstaltninger på ældning, herunder alder-specifik overlevelse og dødelighed, er overordentligt modtagelige for selv mindre variationer i eksperimentel design og miljø, og opretholdelse af strenge laboratoriepraksis for varigheden af aldrende eksperimenter er påkrævet. Disse betragtninger, sammen med behovet for at praktisere omhyggelig kontrol af genetisk baggrund, er af afgørende betydning for at skabe robuste målinger. Faktisk er der mange bemærkelsesværdige kontroverser omkring slutning fra levealder forsøg i gær, orme, fluer og mus, der er blevet sporet til miljømæssige eller genetiske artefakter 1-4. I denne protokol, beskriver vi en række procedurer, der er blevet optimeret gennem mange års måling levetid i Drosophila hjælp laboratorium hætteglas. Vi beskriver også anvendelsen af dLife software, som blev udviklet af vort laboratorium og kan hentes ( http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / software). dLife accelererer throughput og fremmer god praksis ved at indarbejde optimale eksperimenterende design, forenkle flyve håndtering og indsamling af data, og standardisere data analyse. Vi vil også diskutere de mange potentielle faldgruber i design, indsamling, og fortolkning af levetid data, og vi leverer skridt til at undgå disse farer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen præsenteres her beskriver en fremgangsmåde til fremstilling af reproducerbare målinger af voksne levetid i Drosophila som er passende til vurdering af genetiske, farmakologiske, og miljømæssige tiltag. Afgørende aspekter af protokollen omfatter omhyggelig styring af larveudvikling miljø, minimere voksen stress, og minimerer skævhed tværs forsøgsgrupper og kontroller. Vi præsenterer også brugen af dLife levetid eksperimentet management software. Ved blot at fastgøre en stregkode el…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af midler fra Ellison Medical Foundation (SDP, http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp ), NIH K01AG031917 (NJL, http://www.nih.gov/ ), NIH 5T32GM007315-35 (JR) og NIH R01AG030593 (SDP). Dette arbejde udnyttede ressourcerne i Drosophila Aging Core (DAC) af Nathan Shock Center of Excellence i Biologi af de aldrende finansieret af National Institute of Aging P30-AG-013.283 ( http://www.nih.gov/ ). Forfatterne vil gerne takke Pletcher Laboratorium for personer diskussioner og især Brian Chung for kritisk læsning af manuskriptet. Vi vil gerne anerkende Nick Asher og Kathryn Borowicz for assistance med indsamling af data.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Active Dry Yeast | Fleishmann’s Yeast | 2192 | |
| Grape Agar Powder Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Large Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| Large Replacement End Caps | Genesee Scientific | 59-103 | |
| 6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Flugs Closures for Stock Bottles | Genesee Scientific | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide, Polystrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
| Flugs Closures for Wide Vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Wide Orifice Aardvark Pipet Tips, 200 ul | Denville Scientific | P1105-CP | |
| Flystuff Flypad, Standard Size | Genesee Scientific | 59-114 | |
| BD Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 O.D. x 15 mm H; | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Kimax* Colorware Flasks 1,000 ml yellow | Fisher Scientific | 10-200-47 | |
| PBS pH 7.4 10x | Invitrogen | 70011044 | |
| Gelidium Agar | Mooragar | n/a | |
| Brewer’s Yeast | MP Biomedicals | 0290331280 | |
| Granulated Sugar | Kroger | n/a | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-266 | Fly Food Preservative |
| Propionic Acid, 99% | Acros Organics | 149300025 | Fly Food Preservative |
| Kanamycin Sulfate | ISC BioExpress | 0408-10G | |
| Tetracycline HCl | VWR | 80058-724 |
Referências
- Toivonen, J. M., et al. No influence of Indy on lifespan in Drosophila after correction for genetic and cytoplasmic background effects. PLoS Genet. 3, e95 (2007).
- Spencer, C. C., Howell, C. E., Wright, A. R., Promislow, D. E. Testing an ‘aging gene’ in long-lived drosophila strains: increased longevity depends on sex and genetic background. Aging Cell. 2, 123-130 (2003).
- Burnett, C., et al. Absence of effects of Sir2 overexpression on lifespan in C. elegans and Drosophila. Nature. 477, 482-485 (2011).
- Bokov, A. F., et al. Does reduced IGF-1R signaling in Igf1r+/- mice alter aging?. PLoS One. 6, e26891 (2011).
- Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosophila Information Service. 34, 117-118 (1960).
- Skorupa, D. A., Dervisefendic, A., Zwiener, J., Pletcher, S. D. Dietary composition specifies consumption, obesity, and lifespan in Drosophila melanogaster. Aging Cell. 7, 478-490 (2008).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metab. 14, 623-634 (2011).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 53, 457-481 (1958).
- Pletcher, S. D. Mitigating the Tithonus Error: Genetic Analysis of Mortality Phenotypes. Sci. Aging Knowl. Environ. 2002, pe14 (2002).
- Pletcher, S. D., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Why do life spans differ? Partitioning mean longevity differences in terms of age-specific mortality parameters. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55, 381-389 (2000).
- Promislow, , Tatar, , Pletcher, , Carey, Below-threshold mortality: implications for studies in evolution, ecology and demography. Journal of Evolutionary Biology. 12, 314-328 (1999).
- Pletcher, Model fitting and hypothesis testing for age-specific mortality data. Journal of Evolutionary Biology. 12, 430-439 (1999).
- Partridge, L., Gems, D. Benchmarks for ageing studies. Nature. 450, 165-167 (2007).
- Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 12602-12607 (2001).
- Ford, D., et al. Alteration of Drosophila life span using conditional, tissue-specific expression of transgenes triggered by doxycyline or RU486/Mifepristone. Exp. Gerontol. 42, 483-497 (2007).
- Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56, 927-935 (2002).
- Smith, E. M., et al. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J. Nutr. 137, 2006-2012 (2007).
- Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. J. Insect Physiol. 47, 1301-1307 (2001).
- Bass, T. M., et al. Optimization of dietary restriction protocols in Drosophila. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 62, 1071-1081 (2007).
- Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of Ageing and Development. 5, 347-370 (1976).
- Pittendrigh, C. S., Minis, D. H. Circadian systems: longevity as a function of circadian resonance in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1537-1539 (1972).
- Joshi, A., Mueller, L. D. Adult crowding effects on longevity in Drosophila melanogaster: Increase in age-dependent mortality. Current Science. 72, 255-260 (1997).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 8253-8256 (2007).
- Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2498-2503 (2008).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
