C. elegans Chemotaxis Assay
Summary
Procédé d'évaluation quantitative de la réponse chimiotactique des<em> Caenorhabditis elegans</em> Est décrite. Un indice chimiotactique (CI) a été utilisé comme un moyen d'évaluer précisément la réponse des vers de terre pour certaines cibles, et de servir de plate-forme de comparaison entre les souches et les composés d'intérêt.
Abstract
De nombreux organismes utiliser chemotaxis à rechercher des sources de nourriture, éviter les substances nocives, et trouver des partenaires. Caenorhabditis elegans a un comportement de chimiotactisme impressionnant.
La prémisse de tester la réponse des vers à une substance odorante est de les placer dans une zone et observer le mouvement évoquée en réponse à une substance odorante. Même avec les nombreux tests disponibles, l'optimisation ver lieu de départ par rapport à la fois le contrôle et d'essai, tout en minimisant l'interaction du virus avec l'autre, tout en conservant une taille importante de l'échantillon reste un travail en cours 1-10. La méthode décrite ici a pour but de remédier à ces problèmes en modifiant le dosage développée par Bargmann et al. 1. Une boîte de Pétri est divisé en quatre quadrants, deux quadrants opposés marqués "Test" et deux sont désignés "Control". Anesthésique est placé dans tous les essais et les sites témoins. Les vers sont placés au centre de la plaque avec une Circle marquée autour de l'origine de veiller à ce que les vers non mobiles seront ignorés. Utilisant un système à quatre quadrants plutôt que 2 ou deux 1 élimine biais dans le mouvement des vers, car ils sont à égale distance à partir d'échantillons de test et de contrôle, quel que soit le côté de l'origine, ils ont commencé. Cela évite le problème de vers peuvent être contraints de voyager à travers un ensemble d'autres vers de terre pour répondre à une substance odorante, ce qui peut retarder les vers ou les forcer à prendre une voie plus détournée, ce qui donne une interprétation erronée de leur trajectoire prévue. Cette méthode présente également des avantages pratiques en ayant une taille d'échantillon plus large et permettant au chercheur d'exécuter le test sans surveillance et marquer les vers une fois le temps imparti est écoulé.
Introduction
Ward abord développé le test de chimiotactisme en 1973 5, et depuis lors il a eu des applications de grande envergure. Neurobiologie est un domaine qui a bénéficié de l'aide d'une variété d'essais de chimiotaxie. Adaptation olfactive, une forme simple d'apprentissage et la mémoire, a été démontrée dans C. elegans utilisant des dosages de chimiotaxie 6. Ils ont également été utilisés pour montrer que C. elegans peuvent développer l'éthanol tolérance un résultat qui démontre non seulement la plasticité comportementale des vers, mais qui montre aussi que les vers peuvent être très utiles dans l'étude de la dépendance à l'alcool chez l'homme 3. Les analyses ont même été élaborés pour démontrer la capacité de C. elegans de stocker court et la mémoire à long terme, en montrant que les associations sont faites par les vers entre chemoattractants et alimentaires (OP50) 7. En outre, étant donné les nombreuses informations disponibles au sujet de la C. elegans génome, le chemotaxile comportement de C. elegans a été modifié à plusieurs reprises par l'induction de mutations 1,8. Cela permet de nombreuses possibilités d'ingénierie passionnants, tels que le développement de C. elegans comme un outil de bioremédiation. Ainsi, depuis le développement initial de l'essai de chimiotaxie en 1973, il a été souvent modifié et utilisé pour élucider des mystères dans une variété de disciplines.
Certains tests visant à découvrir l'itinéraire spécifique prise par les vers vers une cible. Le test prototype de ce genre a été développé par Ward 5. Trois vers ont été placés sur gélose fondue pendant 15 min. Leurs mouvements ont été tracées par l'empreinte qu'ils ont quitté alors qu'ils se rendaient à la périphérie de la plaque jusqu'à un dégradé à un appât au centre de la plaque. Tous les vers sur la plaque ont été arrêtés avec du chloroforme à la fin de chaque essai. Un descendant de cette méthode d'une seule vis sans fin placée dans le milieu de la plaque avec l'attractif et le contrôle d'unt distances égales et opposées de l'origine 2.
Pierce-Shimomura et al. développé un test pour observer la nature exacte du mouvement impliqué dans le chimiotactisme 9. Vers individuelles ont été placés dans des boîtes de Pétri de 9 cm soit contenant une concentration uniforme de l'appât ou un dégradé radial en forme, aboutissant à la source de l'attractif. Un programme de logiciel d'ordinateur qui a reconnu la vis sans fin est utilisé pour enregistrer le comportement observé. Une caméra vidéo fixée à un microscope travaille en conjonction avec l'étape d'ajuster automatiquement la boîte de Pétri que l'essai de court à assurer le ver est resté dans le champ de vision. Sur cette base, des informations plus détaillées a été découvert sur la cause de pirouettes affichées par C. elegans.
D'autres épreuves, plus semblable à celle décrite ici, tester la réponse d'une population de vers de composés à tester. Dosages de chimiotaxie deux quadrants ont étéutilisés pour explorer les rôles que les différents neurones, des récepteurs et des molécules de transduction des signaux lus lorsque C. elegans ont été exposés à divers composés 1. Entre 20 à 50 vers la chaux ont été placés à proximité du centre de la plaque avec une substance attractive et d'un contrôle au niveau des extrémités polaires ainsi que l'anesthésique, l'azoture de sodium (NaN3). Après 60 min, un indice chimiotactique avec des valeurs de -1,0 à 1,0 a été générée sur la base de la différence entre le nombre de vers de terre ont été fixés sur l'attractif ou la commande. Un indice chimiotactique similaire a été utilisée dans le dosage indiqué dans cet article, bien que le test plus tôt n'a pas réussi à évaluer rigoureusement les vers non mobiles. Ce test a ensuite été appliqué à la suite de tester les effets de l'ablation neuronale sur la chimiotaxie.
Une autre variante de l'essai ci-dessus a été réalisée de 100 à 200 où les vers ont été placés au centre d'une plaque contenant quatre quadrants 3. Quadrants adjacents contenaient soit le test ousubstance contrôler. Comme dans les tests précédents, les vers ont été immobilisées par l'action de l'azoture de sodium, avant d'être marqué. Une méthode similaire est décrite ici comme un moyen d'évaluer la réponse de C. elegans à différents composés. Cependant, la méthode ci-dessous présente l'avantage supplémentaire de seulement évaluer les vers qui ont passé un seuil de distance séparant mobile à partir vers immobiles.
D'autres essais ont incorporé des directives similaires pour ignorer les vers immobiles. Frøkjær-Jensen et al. mis au point un test polyvalent qui peut être utilisé pour tester des composés solubles à la fois volatiles et l'eau 10. Une boîte de Pétri a été divisé en quatre quadrants. Les quadrants du haut et du bas ne contiennent pas de solvants. Le quadrant gauche contenait de l'eau, et le droit contenait la substance attractive. Lors du test de substances odorantes volatiles, l'analyte a été placé sur le couvercle de la boîte, sur le quadrant approprié, tandis que les composés solubles dans l'eau ont été placés directement sur l'agar.
Les méthodes actuellement en vigueur pour l'évaluation de la réponse chimiotactique de C. elegans sont constamment affinés pour optimiser leur facilité d'utilisation, l'efficacité et la précision. Ainsi, alors que le test décrit ici a la capacité d'évaluer le plus grand nombre de vers (débit maximal:. 250 vers / heure par plaque, légèrement supérieur au débit démontré par Lee et al 3); la véritable force de cette méthode est l' succinct aboutissement de plusieurs des attributs d'essais antérieurs (tableau 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Chemotaxis, bien que contrôlé par un ensemble complexe de mécanismes neuronaux et cellulaire, peut être facilement et objectivement quantifiée en utilisant des dosages de chimiotaxie. Pour obtenir les meilleurs résultats des tests, certaines étapes cruciales doivent être prises. Tout d'abord, la mise en scène des vers est essentiel à donner des résultats expérimentaux cohérents. Worms à différents stades de la vie comportent différemment 13; vers la scène de manière mixte peut fausser le…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions sciences de la vie et de la Faculté des arts et des sciences de l'Université Queen pour le financement de ces travaux. De plus, nous remercions le laboratoire Chin-Sang pour fournir les réactifs nécessaires, l'équipement et le soutien technique. Nous remercions également QGEM 2011 surtout Tony Il pour sa contribution à la discussion.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave | |||
| PicoFuge | Stratagene | 400552 | |
| Microscopes | Leica | ||
| Dissecting | Leica | ||
| P1000 Pipette | Gilson | ||
| P10 Pipette | Gilson | ||
| 0.5 M Sodium Azide | |||
| Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4] | |||
| Ethanol/Distilled Water | |||
| Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl) | |||
| Agar | Bio-Rad | 166-0600 | |
| NH4Cl | Amresco | CA97062-046 | |
| MOPS | VWR | CA12001-120 | |
| NH4OH | BDH | CABDH8641-2 | |
| 0.25% Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 |
Referências
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74, 515-527 (1993).
- Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7, 729-742 (1991).
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