C. elegans Chemotaxis-Assay
Summary
Verfahren zur quantitativen Bewertung der chemotaktischen Reaktion von<em> Caenorhabditis elegans</em> Beschrieben. A chemotaktischen Index (CI) wurde als eine Möglichkeit, genau zu ermitteln Reaktion von Würmern zu bestimmten Zielen und als Plattform des Vergleichs zwischen Stämmen und Verbindungen von Interesse verwendet.
Abstract
Viele Organismen verwenden Chemotaxis zu suchen, Nahrungsquellen, vermeiden Schadstoffe und finden mates. Caenorhabditis elegans hat eine beeindruckende Chemotaxis Verhalten.
Die Prämisse Prüfung des Ansprechens die Würmer zu einem Duftstoff ist, sie in einem Bereich zu platzieren und beobachten die Bewegung in Reaktion auf einen Geruchsstoff hervorgerufen. Auch mit den vielen verfügbaren Assays optimieren Wurm Ausgangsposition relativ zu sowohl der Steuer-und Testflächen, bei gleichzeitiger Minimierung der Interaktion von Würmern mit einander, während eine signifikante Stichprobengröße bleibt ein work in progress 1-10. Die hier beschriebene Methode zielt darauf ab, diese Probleme durch Änderung der Assay durch Bargmann et al. 1 entwickelt anzugehen. Eine Petrischale in vier Quadranten unterteilt ist, sind zwei gegenüberliegende Quadranten mit der Aufschrift "Test" und zwei "Control" bezeichnet. Betäubungsmittel wird in allen Test-und Kontrollgruppe Websites platziert. Die Würmer sind in der Mitte der Platte mit einem circl platzierte um den Ursprung markiert, um sicherzustellen, dass unbewegliche Würmer werden ignoriert. Mit Hilfe eines Vier-Quadranten-System anstatt einer 2 oder zwei 1 eliminiert Verzerrungen bei der Bewegung der Würmer, da sie gleich weit von Test-und Kontrollproben sind, unabhängig davon, auf welcher Seite des Ursprungs sie begann. Dies umgeht das Problem der Würmer ist gezwungen, durch ein Cluster von anderen Würmern zu reisen, um zu einem Geruchsstoff, die Würmer verzögern können oder sie zu zwingen, einen Umweg zu nehmen, was zu einer falschen Interpretation ihrer vorgesehenen Weg zu reagieren. Diese Methode zeigt auch praktische Vorteile durch einen größeren Stichprobenumfang und so der Forscher, um die Assay unbeaufsichtigt laufen und schießen die Würmer, wenn die Redezeit ist abgelaufen.
Introduction
Ward entwickelte die erste Chemotaxisassay 1973 5, und seitdem hat weitreichende Anwendungen. Neurobiologie ist ein Feld, das von der Verwendung einer Vielzahl von Chemotaxisassays profitiert hat. Olfaktorischen Adaption, eine einfache Form von Lernen und Gedächtnis, hat in C nachgewiesen elegans mit Chemotaxisassays 6. Sie sind auch verwendet worden, um zu zeigen, dass C. elegans entwickeln können Ethanol-Toleranz ein Ergebnis, das zeigt nicht nur das Verhalten Plastizität der Würmer, aber das zeigt auch, dass die Würmer kann sehr nützlich sein bei der Untersuchung der Abhängigkeit von Alkohol in Menschen 3. Assays wurden auch entwickelt, um die Fähigkeit zu demonstrieren C. elegans zu speichern kurz-und langfristigen Speicher durch die zeigen, dass Verbände von den Würmern zwischen Lockstoffe und Nahrungsmittel (OP50) 7 gemacht werden. Darüber hinaus die umfangreichen derzeit verfügbaren Informationen über die C gegeben elegans Genoms, die chemotaxis Verhalten von C. elegans wurde mehrfach durch Mutationen induzieren 1,8 verändert. Dies ermöglicht viele spannende Möglichkeiten Engineering, wie die Entwicklung von C. elegans als bioremediation Tool. So, da die anfängliche Entwicklung des Chemotaxis-Assay im Jahr 1973 hat es sich häufig verändert und verwendet, um Geheimnisse in einer Vielzahl von Disziplinen aufzuklären.
Bestimmte Tests zum Ziel, die spezifische Route von den Würmern zu einem Ziel gemacht zu entdecken. Die prototypische Assay dieser Art wurde von Ward 5 entwickelt. Drei Würmer wurden am geschmolzene Agar für 15 min platziert. Ihre Bewegungen wurden durch den Aufdruck sie bleiben, wie sie von der Peripherie der Platte bis zu einer Steigung ein Lockmittel in der Mitte der Platte reiste zurückverfolgt. Alle Würmer auf der Platte wurden verhaftet mit Chloroform am Ende jeder Studie. Ein Nachkomme dieser Methode platziert einen einzigen Wurm in der Mitte der Platte mit dem Lockstoff und der Kontrolle einert gleich und entgegengesetzt Abstände vom Ursprung 2.
Pierce-Shimomura et al. entwickelte einen Test, um die genaue Art der Bewegung in Chemotaxis 9 beteiligt beobachten. Einzelne Würmer wurden in 9 cm Petrischalen entweder mit einer einheitlichen Konzentration der Lockstoff oder einer radialen geformten Verlauf angeordnet ist, die ihren Höhepunkt in der Quelle der Lockstoff. Ein Computer-Software-Programm, das die Schnecke erkannt wurde verwendet, um das beobachtete Verhalten aufzuzeichnen. Ein Video-Kamera, die an einem Mikroskop gearbeitet in Verbindung mit der Stufe, um die Petrischale automatisch als der Test lief, um sicherzustellen, die Schnecke blieb im Blickfeld. Daraus wurde mehr detaillierte Informationen über die Ursache entdeckt Pirouetten von C. angezeigt elegans.
Andere Tests, ähnlich wie die hier beschriebenen, testeten die Reaktion von einer großen Population von Würmern zu testen Verbindungen. Zwei-Quadranten-Chemotaxis-Assays wurdenverwendet werden, um die Rollen zu erforschen, die verschiedenen Neuronen, Rezeptoren und Signaltransduktionsmoleküle wenn C gespielt elegans wurde verschiedenen Verbindungen 1 ausgesetzt. 20-50 gewaschenen Würmer in der Nähe der Mitte der Platte mit einem Lockstoff und eine Steuereinheit an polaren Enden zusammen mit dem Anästhetikum, Natriumazid (NaN 3) angeordnet ist. Nach 60 min wurde eine chemotaktischen Index mit Werten von -1,0 bis +1,0 der Grundlage der Differenz zwischen dem, wie viele Würmer wurden dem Lockstoff oder der Steuerung befestigt erzeugt. Eine ähnliche chemotaktischen Index wurde in dem Assay in diesem Artikel berichtet verwendet, obwohl die zuvor Assay nicht streng bewerten unbewegliche Würmer. Dieser Assay wurde dann weiter auf das Testen der Wirkungen von neuronalen Ablation auf die Chemotaxis aufgebracht.
Eine weitere Variante des vorstehend genannten Assay wurde durchgeführt, wobei 100-200 Würmer in der Mitte einer Platte mit vier Quadranten 3 angeordnet wurden. Benachbarten Quadranten enthalten entweder den Test oderKontrollsubstanz. Wie in früheren Untersuchungen wurden die Würmer durch Einwirkung von Natriumazid bevor erzielt immobilisiert. Ein ähnliches Verfahren wird hier als eine Möglichkeit der Auswertung der Reaktion von C beschrieben elegans, um verschiedene Verbindungen. Jedoch hat das Verfahren unter den zusätzlichen Vorteil, nur die Bewertung Würmer, die einen Schwellenwert trennende Abstand von unbeweglichen Würmer mobilen bestanden haben.
Andere Tests haben ähnliche Richtlinien zu ignorieren immobile Würmer eingearbeitet. Frøkjær-Jensen et al. entwickelten ein vielseitiges Assay, der zum Testen sowohl flüchtige als auch wasserlösliche Verbindungen 10 werden kann. Eine Petrischale wurde in vier Quadranten unterteilt. Die oberen und unteren Quadranten nicht enthalten Lösungsmittel. Die linken Quadranten enthalten Wasser und die rechte enthielt das Lockmittel. Beim Testen flüchtige Riechstoffe wurde der Analyt auf dem Deckel der Schale angeordnet ist, über den entsprechenden Quadranten, während wasserlösliche Verbindungen wurden direkt am aga platziertr.
Die Verfahren, die derzeit existieren für die Bewertung der chemotaktischen Reaktion von C. elegans werden ständig verfeinert, um ihre Benutzerfreundlichkeit, Effizienz und Genauigkeit zu optimieren. Also, während der Test hier beschrieben hat die Fähigkeit zur Beurteilung der größten Anzahl von Würmern (maximaler Durchsatz:. 250 Würmer / Stunde pro Platte, etwas größer als der Durchsatz von Lee et al 3 gezeigt), die wahre Stärke dieser Methode ist die prägnanten Höhepunkt von vielen der Attribute der früheren Assays (Tabelle 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Chemotaxis, obwohl durch eine komplexe Reihe von neuronalen und zellulären Mechanismen gesteuert werden, können leicht und objektiv quantifiziert mit Chemotaxisassays sein. Um die besten Ergebnisse aus den Tests zu erhalten, müssen bestimmte kritische Schritte unternommen werden. Erstens, die Inszenierung der Würmer ist wichtig, was in Einklang experimentellen Ergebnisse. Worms in verschiedenen Lebensphasen unterschiedlich verhalten 13; so gemischten Bühne Würmer können Skew experimentellen Ergebnisse….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Life Sciences und der Fakultät der Künste und Wissenschaften an der Queens University für die Finanzierung dieser Arbeit. Ebenso danken wir der Chin-Sang Labor für die Bereitstellung der benötigten Reagenzien, Geräte und technische Unterstützung. Wir danken auch QGEM 2011 vor allem Tony Er für seinen Beitrag zu der Diskussion.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave | |||
| PicoFuge | Stratagene | 400552 | |
| Microscopes | Leica | ||
| Dissecting | Leica | ||
| P1000 Pipette | Gilson | ||
| P10 Pipette | Gilson | ||
| 0.5 M Sodium Azide | |||
| Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4] | |||
| Ethanol/Distilled Water | |||
| Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl) | |||
| Agar | Bio-Rad | 166-0600 | |
| NH4Cl | Amresco | CA97062-046 | |
| MOPS | VWR | CA12001-120 | |
| NH4OH | BDH | CABDH8641-2 | |
| 0.25% Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 |
Referências
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74, 515-527 (1993).
- Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7, 729-742 (1991).
- Lee, J., Jee, C., McIntire, S. L. Ethanol preference in C. elegans. Genes Brain Behav. 8, 578-585 (2009).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8, 592-598 (2011).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 817-821 (1973).
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14, 803-812 (1995).
- Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).
- Troemel, E. R., Kimmel, B. E., Bargmann, C. I. Reprogramming chemotaxis responses: sensory neurons define olfactory preferences in C. elegans. Cell. 91, 161-169 (1997).
- Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J Neurosci. 19, 9557-9569 (1999).
- Frokjaer-Jensen, C., Ailion, M., Lockery, S. R. Ammonium-acetate is sensed by gustatory and olfactory neurons in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 3, e2467 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Sengupta, P., Bargmann, C. I. Cell fate specification and differentiation in the nervous system of Caenorhabditis elegans. Dev. Genet. 18, 73-80 (1996).
- Hart, A. C. Behavior. WormBook. , (1895).
