myofibers의 절연과 문화는 황금 표준입니다<em> 체외에서</em정지, 활성화 및 차별화를 통해 위성 세포의 전환을 공부하기> 시스템입니다. 중요한 것은 하나의 myofiber 문화 시스템은 근육 줄기 세포 틈새의 필수적인 구성 요소입니다 myofiber / 줄기 세포 연결을 유지합니다.
성인의 근육 재생은 위성 세포라고 주민 줄기 세포에 의해 수행됩니다. 위성 세포는 기저 얇은 판 각 myofiber의 sarcolemma 사이에 자신의 위치에 의해 정의됩니다. 자신의 행동의 현재 지식은 크게 단일 myofiber 격리 프로토콜의 사용에 의존하고 있습니다. 1985 년에 비 쇼프는 myofiber과 줄기 세포 사이의 물리적 연결이 1 보존되는 체외 시스템에를 만드는 것을 목표로 성인 쥐의 Flexor Digitorum Brevis (FDB)에서 하나의 라이브 섬유를 분리하는 프로토콜을 설명했다. 1995 년 비 쇼프 프로토콜 등이 myofibers이 단독으로 데려와 대신 중력 침강 2, 3 분리되는 collagenase를 소화 한 후 별도로 처리됩니다를 Rosenblattmodified. Rosenblatt 또는 비 쇼프 프로토콜은 이후 다른 근육, 연령이나 조건 3-6에 맞게되었습니다. 단일 myofiber 절연 기술은 필수입니다독특한 장점 때문에 도구입니다. 첫째, 단일 myofiber 프로토콜에, 위성 세포는 기저 얇은 판 아래에 유지됩니다. 이러한 형광 활성화 셀 정렬과 같은 다른 기술을 화학 및 기계적 조직 분리 7 필요로이 프로토콜의 독특한 기능입니다. myofiber 문화 시스템은 생체 연구에 대한 대체 할 수 있지만 근육 줄기 세포의 관련 생물학적 속성을 처리 할 수있는 뛰어난 플랫폼을 제공 않습니다. 싱글 myofibers는 표준 도금 조건 또는 부동 조건에서 배양 할 수 있습니다. 부동 myofibers에 위성 세포는 myofiber 환경보다 거의 다른 어떤 영향을 받게됩니다. 기판 강성 및 코팅은 근육 8, 9를 다시 생성 할 수 위성 세포 '능력에 영향을 표시 한 것도 이러한 요소의 각을 제어 할 수있는 것은 독립적으로 할 수 있습니다 틈새 시장에 의존하고 독립적 인 반응 사이의 차별. 혈청의 다른 농도가또한 정지에서 활성으로의 전환에 영향을 가지고 표시되었습니다. 관련 위성 세포의 정지 상태를 유지하려면 섬유는 1-3 낮은 혈청 매체에 보관해야합니다. 정지 상태에 관련된 유전자를 연구 할 때 특히 유용합니다. 혈청 풍부한 매체에, 위성 세포가 빠르게 활성화, 따라서 1-3 생체 재생 과정에를 모방, 마이그레이션 및 차별화, 세포 분열 따위에 의해 번식. 바이러스 배달 유전자의 이소성 표현; oligonucleotide 기반의 유전자 똑 다운 또는 라이브 이미징 시스템은 이러한 화학 억제제의 테스트와 같은 assays의 다양한을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 비디오 문서는 현재 성인 마우스 (6-8주 이전)의 신근 Digitorum의 Longus (편집 판단리스트) 근육에서 단일 myofibers를 분리하기 위해 실험실에서 사용되는 프로토콜을 설명합니다.
그대로 근육의 단일 myofibers의 절연 및 문화 근육 재생의 과정을 공부하는 체외 모델에 우수한를 제공합니다. 이 시스템의 고유 기능은 기저 얇은 판 아래의 생리적 환경에서 위성 세포의 보존입니다. 가장 중요한 기술은 정지하고 활성 상태 모두에서 근육 줄기 세포의 행동을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 지난 20 년 동안 myofiber 문화 시스템은 고유 및 외부 determinants 모두에 대해 위성 세포 인구의 생물에 의미있는 통찰력을 제공하고 있습니다. 배양 개인의 myofibers으로 myofiber, 근육 입력하거나 재생 가능성과 관련하여 위성 세포 이질성은 15 해결되었습니다. 위성 세포 이주 패턴 16 획득 정보를 허용 한 배양 섬유의 라이브 영상을 사용하여 정교한 연구. 양적 데이터의 취득은수 LSO. 시간이 많이 있지만, 특정 이벤트 (줄기 세포 비대칭 분할, 증식과 분화 비율 등)의 유통 및 발생에 관한 중요한 정보를 제공합니다. FACS 또는 기타 수단으로 위성 세포의 순수한 인구의 분리는 분자 수준에서 단백질이나 유전자 표현 변화를 조사 할 수있는 좋은 플랫폼을 제공 할 수 있지만 함께 이전에 설명 된 응용 프로그램과 단일 섬유에서 단백질이나 RNA 추출도 가능합니다. 우리의 경험에서 성공적인 섬유 절연을위한 가장 중요한 단계는 절연 (2.5-2.9 프로토콜 텍스트의 단계) "힘줄에 힘줄이"입니다. 이 근육 소화 한 후, 섬유 최소한의 또는 전혀 손상이 때문에 다음 단계에서 자신의 성능을 증가와 함께 편집 판단리스트에서 해제되어 있는지 보장합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 중요한 읽기와 의견을 제공하는 사라 딕 감사드립니다. MAR는 분자 유전학의 캐나다 연구 의자를 보유하고 하워드 휴즈 의학 연구소의 국제 연구 학술 수 있습니다. 이 작품은 국립 보건원, 하워드 휴즈 의학 연구소, 건강 연구의 캐나다 연구소, 근육질 영양 장애 협회와 캐나다 연구 의자 프로그램에서 MAR에 대한 교부금에 의해 지원되었다.
Reagent/Material | |||
Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130-1g | Prepare fresh all times for optimal results. Additional aliquots of undiluted collagenase can be stored at -20 °C. |
DMEM High Glucose + NaPyr | Invitrogen | 11995073 | Addition of Pen/Strep is necessary to minimize air contaminations |
Characterized Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | Lot #KUJ35152 |
Horse Serum | Hyclone | SH300.74.03 | Lot #AVJ82494 |
Chicken Embryo Extract | Accurate Chemical | CE-650-T, Batch B7035010 | Avoid freezing-thawing cycles. |
Matrigel | BD | Store aliquots at -20 °C. Avoid freezing-thawing cycles. Store diluted aliquots at 4 °C. | |
Equipment | |||
Cohann-Vannas Spring Scissor 6mm Blades-Straight-Sharp | Fine Science Tools | 15000-02 | |
Extra Thin Iris Scissors- 10.5cm | Fine Science Tools | 14088-10 | |
Moria-Iris Forceps Curved | Fine Science Tools | 11373-12 | |
Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 | 14672-200 |
Diamond Pen | VWR | 52865-005 | |
60*15mm Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
Acrodisc 0.22 μm Filter | VWR | CA28-145-477 | |
Dissecting Microscope StemiV6 | Zeiss | An additional light source may be required to have a better focus view |