Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation
Summary
Wir beschreiben eine Live-Cell-Imaging-Verfahren, das einen Einblick in die Dynamik Protein während der T-Zell-Aktivierung. Wir zeigen die kombinierte Nutzung des T-Zell-Ausbreitung Assay, konfokale Mikroskopie und Bildanalyse zu liefern quantitative Ergebnisse zu folgen Signalisierung Komplexbildung während T-Zell-Aktivierung.
Abstract
Schutz gegen Infektionskrankheiten durch das Immunsystem vermittelt 1,2. T-Lymphozyten sind die Master Koordinatoren des Immunsystems, der Regulierung der Aktivierung und Antworten mehrerer Immunzellen 3,4. T-Zell-Aktivierung ist abhängig von der Erkennung von Antigenen durch Antigen-präsentierende Zellen (APCs) angezeigt. Die T-Zell-Antigen-Rezeptor (TCR) ist spezifisch für jedes T-Zell-Klon und bestimmt Antigenspezifität 5. Die Bindung des TCR auf das Antigen induziert die Phosphorylierung von Komponenten des TCR-Komplexes. Um den T-Zell-Aktivierung zu fördern, müssen dieses Signal von der Membran in das Zytoplasma und den Zellkern transduziert Einleiten verschiedenen entscheidenden Reaktionen wie Einstellung der Signal-Proteinen an die TCR; APC Website (Immunsynapse), deren molekulare Aktivierung Zytoskelett-Umlagerung Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration, und Veränderungen in der Genexpression 6,7. Die richtige initiation und Beendigung der Aktivierungssignale ist entscheidend für die entsprechenden T-Zell-Reaktionen. Die Aktivität der Signalproteine ist abhängig von der Bildung und Auflösung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, posttranslationale Modifikationen wie Protein-Phosphorylierung die Bildung von Protein-Komplexe, Protein Ubiquitin und die Rekrutierung von Proteinen an verschiedenen zellulären Seiten 8. Das Verständnis, das Innenleben des T-Zell-Aktivierung ist entscheidend sowohl für die immunologische Forschung und klinische Anwendungen.
Verschiedene Tests wurden entwickelt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen, aber biochemische Assays, wie dem weit verbreiteten Co-Immunopräzipitation Methode nicht zulassen Protein Lage zu sein, erkannt und somit auch keine Beobachtung wertvolle Einblicke in die Dynamik zellulärer Mechanismen. Zusätzlich können diese Masse Assays kombinieren üblicherweise Proteine aus verschiedenen Zellen, die möglicherweise in verschiedenen Stadien der ter untersucht zellulären Prozess. Dies kann sich nachteilig auf die zeitliche Auflösung. Die Verwendung von Echtzeit-Bildgebung lebender Zellen ermöglicht sowohl die räumliche Verfolgung von Proteinen und die Fähigkeit, zeitlich zwischen Signalwege zu unterscheiden, damit Licht auf die Dynamik des Prozesses 9,10. Wir stellen ein Verfahren zur Echtzeit-Bildgebung von Signalisierungs-Komplexbildung bei T-Zell-Aktivierung. Primären T-Zellen oder T-Zell-Linien, wie Jurkat sind mit Plasmiden, die für Proteine von Interesse fusioniert an monomeren fluoreszierenden Proteine transfiziert verhindert unphysiologische Oligomerisierung 11. Live-T-Zellen werden in einem Deckglas vorbeschichtet mit T-Zell-aktivierende Antikörper 8,9, die dem CD3/TCR Komplex bindet und induziert T-Zell-Aktivierung unter Überwindung der Bedarf an speziellen aktivierende Antigene fallen gelassen. Aktivierten Zellen werden ständig mit der Verwendung der konfokalen Mikroskopie abgebildet. Imaging Daten werden analysiert, um quantitative Ergebnisse, wie die Ausbeute colocalization Koeffizient der Signal-Proteinen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Regulation und Funktion von mehreren zellulären Prozessen abhängig von der Bildung und Auflösung von Protein-Protein-Interaktionen. Mikroskopische Bildgebung ermöglicht die Echtzeit-Tracking von fluoreszierend markierten Proteinen in lebenden Zellen. Kolokalisation markierter Proteine deuten auf eine direkte oder indirekte Wechselwirkung zwischen den Proteinen und kann verwendet werden, um Erkenntnisse durch biochemische Methoden wie Immunpräzipitation erhalten verstärken. Im Gegensatz zu biochemischen M…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Sophia Fried für die technische Unterstützung. MBS dankt den folgenden Organisationen für ihre Unterstützung der Forschung: Die Israel Science Foundation für Finanzhilfen no.1659/08, 971/08 1503/08 und 491/10, die Ministerien für Gesundheit & Science Zuschüsse Nr. 3-4114 und 3-6540, die Israel Cancer Association durch das Anwesen des verstorbenen Alexander Smidoda und die Taubenblatt Family Foundation für die Bio-Medizin Exzellenz Zuschuss.
Materials
| Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa human T Cell nucleofector kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Anti CD3 (UCHT1 clone) | BioLegend | 300432 | |
| Falcon FACS Tubes | Becton Dickinson | 352058 | |
| FCS | HyClone | SV30160.03 | |
| G418 | Calbiochem | 345810 | |
| German coverglass system 4 chamber slides | Lab-Tek II | 155382 | |
| HCl | Bio Lab | 8410501 | |
| Hepes | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Hygromycin | Enzo | ALX-380-306 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| PBS (10X) | Sigma | D1408 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | |
| Poly-L-lysine 0.1% (w/v) in H2O | Sigma | P8920 | |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Equipment | |||
| Accublock digital dry bath | Labnet | D1105A | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta | |
| Heatable mounting frame – Heating Insert P S | PeCon | 130-800-031 | |
| TempModule S (required for the heatable mounting frame) | Zeiss | 411860-9010-000 | |
| Electroporation device | Amaxa | Nucleofector I | |
| Fluorescence activated cell sorter | Becton Dickinson | FACSVantage SE | |
| Image analysis software | Bitplane | 7.0.0 |
Referências
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