הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס
Summary
אנו מתארים שיטת הדמיה לחיות תאים המספקת תובנה דינמיקת חלבון במהלך תהליך תא T ההפעלה. אנו מדגימים את השימוש בשילוב של הפצת assay תא T, מיקרוסקופיה confocal וניתוח הדמיה להניב תוצאות כמותיות לעקוב איתות היווצרות מורכבת לאורך כל הפעלת תא T.
Abstract
הגנה מפני מחלות זיהומיות מתווכת על ידי 1,2 המערכת החיסונית. לימפוציטים מסוג T הם רכזי האב של מערכת החיסון, המסדיר את ההפעלה ותגובות של תאים חיסוניים 3,4 מרובים. הפעלת תא T תלויה בהכרה של אנטיגנים ספציפיים המוצגים על ידי תאי מציגי אנטיגן (נגמ"שים). קולט אנטיגן T-cell (TCR) ספציפי לכל שיבוט תאי T וקובע סגוליות אנטיגן 5. הכריכה של TCR לאנטיגן גורמת לזירחון של מרכיבי קומפלקס TCR. על מנת לקדם את הפעלת תא T, אות זה חייב להיות transduced מן הקרום אל הציטופלסמה והגרעין, ייזום תגובות שונות חיוניות כגון גיוס של חלבוני איתות לTCR; אתר APC (סינפסה החיסונית), ההפעלה המולקולרית שלהם, סידור מחדש cytoskeletal, גובה של ריכוז סידן תוך תאי, ושינויים בביטוי גני 6,7. הנכוןitiation וסיום של אותות המפעילים הוא קריטי לתגובות תא T המתאימות. הפעילות של חלבוני איתות תלויה בהיווצרות וסיום האינטראקציות בין חלבונים, לפרסם שינויי translational כגון זרחון חלבון, היווצרות של קומפלקסי חלבונים, ubiquitylation החלבון וגיוס של חלבונים לאתרים שונים 8 סלולריים. הבנת הפעולה הפנימית של תהליך הפעלת תא T היא קריטית עבור מחקר חיסוני ויישומים קליניים.
מבחני שונים פותחו כדי לחקור אינטראקציות בין חלבונים, עם זאת, מבחני ביוכימיים, כגון שיטת שיתוף immunoprecipitation בשימוש נרחב, אינם מאפשרים מיקום חלבון להיה להבחין, ובכך נמנע אפשרות התצפית של תובנות רבות ערך לדינמיקה של הסלולר מנגנונים. בנוסף, מבחני אלה בדרך כלל בתפזורת לשלב חלבונים מהתאים רבים ושונים שעשויות להיות בשלבים שונים של t שוניםהוא חקר את התהליך סלולרי. זה יכול להיות השפעה מזיקה על החלטה זמנית. השימוש בהדמיה בזמן אמת של תאי חיים מאפשר גם מעקב המרחבי של חלבונים ואת היכולת להבחין בין temporally אירועי איתות, ובכך שופך אור על הדינמיקה של תהליך 9,10. אנו מציגים שיטה של הדמיה בזמן אמת של היווצרות איתות-מורכבת במהלך הפעלת תא T. T-cell קווים, כגון Jurkat T-תאים ראשוניים או, הם transfected עם פלסמידים קידוד לחלבונים של עניין התמזגו לחלבוני ניאון monomeric, מניעת oligomerization הלא פיסיולוגי 11. חיים תאי T הם ירדו מעל coverslip מראש מצופה עם נוגדן תא T הפעלת 8,9, אשר נקשר למתחם CD3/TCR, גרימת הפעלת תאי T תוך התגברות על הצורך בהפעלת אנטיגנים ספציפיים. תאים הופעל הם צילמו כל הזמן עם השימוש במיקרוסקופיה confocal. נתוני הדמיה מנותחים להניב תוצאות כמותיות, כגון colמקדם ocalization של חלבוני האיתות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הרגולציה והפונקציה של תהליכים תאיים רבים תלויה בהיווצרות וסיום האינטראקציות בין חלבונים. הדמיה מיקרוסקופית מאפשרת מעקב בזמן אמת של חלבונים מתויגים fluorescently בתאים חיים. Colocalization של חלבונים מתויגים יכול להציע אינטראקציה ישירה או עקיפה בין החלבונים, וניתן להשתמש בו כדי…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים סופיה פריד לקבלת סיוע טכני. MBS הסוכנויות מודה הבאות על תמיכת המחקר שלהם: הקרן הלאומית למדע למענקי no.1659/08, 971/08, 1503-1508 ו491 / 10, משרדי בריאות ומדע למענקים אין. 3-4114 ו3-6540, סרטן אגודת ישראל באמצעות עזבון אלכסנדר Smidoda מאוחר, וקרן משפחת Taubenblatt למענק ההצטיינות ביו הרפואה.
Materials
| Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa human T Cell nucleofector kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Anti CD3 (UCHT1 clone) | BioLegend | 300432 | |
| Falcon FACS Tubes | Becton Dickinson | 352058 | |
| FCS | HyClone | SV30160.03 | |
| G418 | Calbiochem | 345810 | |
| German coverglass system 4 chamber slides | Lab-Tek II | 155382 | |
| HCl | Bio Lab | 8410501 | |
| Hepes | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Hygromycin | Enzo | ALX-380-306 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| PBS (10X) | Sigma | D1408 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | |
| Poly-L-lysine 0.1% (w/v) in H2O | Sigma | P8920 | |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Equipment | |||
| Accublock digital dry bath | Labnet | D1105A | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta | |
| Heatable mounting frame – Heating Insert P S | PeCon | 130-800-031 | |
| TempModule S (required for the heatable mounting frame) | Zeiss | 411860-9010-000 | |
| Electroporation device | Amaxa | Nucleofector I | |
| Fluorescence activated cell sorter | Becton Dickinson | FACSVantage SE | |
| Image analysis software | Bitplane | 7.0.0 |
Referências
- Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
- Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
- Doherty, P. C. Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).
- Jager, D., Jager, E., Knuth, A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
- Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. The actin cytoskeleton in T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).
- Reicher, B., Barda-Saad, M. Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network. FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).
- Barda-Saad, M., et al. Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton. Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry A. 77, 733-742 (2010).
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).
- Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity. J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).
- Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).
- Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization. Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).
- Barda-Saad, M., et al. Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization. EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).
- Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. . Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).
