Em tempo real de imagens ao vivo de células T Sinalização de Formação de Complexos

Summary

Nós descrevemos um método de imagem ao vivo de células que fornece insights sobre a dinâmica de proteínas durante o processo de ativação de células-T. Nós demonstramos a utilização combinada de a célula T-ensaio espalhamento, microscopia confocal e análise de imagens para se obter resultados quantitativos para seguir a formação do complexo de sinalização durante a activação de células-T.

Abstract

A protecção contra doenças infecciosas é mediada pelo sistema imunológico ^1,2. Os linfócitos T são os coordenadores mestre do sistema imunitário, que regula a activação e respostas de várias células imunitárias ^3,4. A activação das células T depende do reconhecimento de antigénios específicos apresentados por células apresentadoras de antígenos (APCs). O receptor de antigénio de célula T (TCR) é específico para cada clone de células T e determina a especificidade do antigénio ^5. A ligação do TCR para o antigénio induz a fosforilação dos componentes do complexo TCR. A fim de promover a activação das células T, o sinal deve ser transduzida a partir da membrana para o citoplasma e o núcleo, inicia várias respostas cruciais tais como o recrutamento de proteínas de sinalização para o TCR; da APC (da sinapse imune), a sua activação molecular, rearranjo do citoesqueleto, a elevação da concentração de cálcio intracelular, e as alterações na expressão do gene ^6,7. O correto emitiation e terminação dos sinais de activação é crucial para as respostas de células T apropriadas. A actividade das proteínas de sinalização é dependente da formação e terminação de interacções proteína-proteína, pós translacionais, tais como a fosforilação da proteína, a formação de complexos de proteína, ubiquitinação de proteínas e ao recrutamento de proteínas para vários locais celulares ^8. Compreender o funcionamento interno do processo de ativação de células T é crucial para a pesquisa imunológica e aplicações clínicas.

Diversos ensaios têm sido desenvolvidas a fim de investigar as interacções proteína-proteína, no entanto, os ensaios bioquímicos, tais como o método de co-imunoprecipitação amplamente utilizado, não permitem a localização da proteína para ser discernidos, impedindo assim a observação de informações valiosas sobre a dinâmica de celular mecanismos. Além disso, estes ensaios granel geralmente combinam proteínas de muitas células diferentes que podem estar em diferentes fases da tele investigou processo celular. Isto pode ter um efeito prejudicial na resolução temporal. A utilização de imagens em tempo real de células vivas tanto permite o rastreio espacial das proteínas e a capacidade de distinguir entre os eventos de sinalização temporalmente, derramando assim luz sobre a dinâmica do processo de ^9,10. Apresenta-se um método de imagem em tempo real da formação do complexo de sinalização durante a activação de células-T. As células T primárias ou linhas de células T, como Jurkat, são transfectadas com plasmídeos que codificam para proteínas de interesse fundidos a proteínas fluorescentes monoméricos, impedindo oligomerização não fisiológico ^11. Vivo células T são eliminadas durante uma lamela pré-revestida com anticorpo de activação de células T ^8,9, o qual se liga ao complexo CD3/TCR, indução da activação de células T ao superar a necessidade de antigénios de activação específicas. As células activadas são constantemente fotografada com a utilização de microscopia confocal. Dados de imagem são analisados ​​para produzir resultados quantitativos, como o colcoeficiente ocalization das proteínas de sinalização.

Protocol

1. A transfecção de células T Preparar a solução Nucleofector Amaxa ativado através da mistura de solução "Anexo" do kit para a solução Nucleofector. A solução activada pode ser armazenado a 4 ° C durante até três meses. Cultivar células T de Jurkat em meio de cultura [10% de soro fetal de vitelo (FCS), uma solução de Penicilina-Estreptomicina a 1%, e 2 mM de L-glutamina em meio RPMI]. Idealmente, as células devem ser utilizados 1-2 semanas depois do descongelamento. Uti…

Representative Results

Nós apresentamos um exemplo de imagem de células T ao vivo e análise. Antes do experimento imagiologia, SLP76 células T deficientes (J14) foram analisadas com o uso de FACS para determinar a expressão de proteínas fluorescentes (Figura 1). As células T transfectadas com as proteínas de sinalização etiquetados CGPP-Nck e SLP76-mYFP foram depositadas sobre lâminas de activação e fotografada durante o espalhamento das células-T (Figura 2). Recolhidas as imagens mostram a din?…

Discussion

A regulação e função de vários processos celulares dependem da formação e terminação de interacções proteína-proteína. Imagens microscópicas permite o acompanhamento em tempo real das proteínas fluorescentes marcados em células vivas. Co-localização de proteínas marcadas pode sugerir uma interacção directa ou indirecta entre as proteínas, e podem ser usados ​​para reforçar resultados obtidos por métodos bioquímicos, tais como a imunoprecipitação. Ao contrário de métodos bioquímicos, ima…

Materials

Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Amaxa human T Cell nucleofector kit	Lonza	VCA-1002
Anti CD3 (UCHT1 clone)	BioLegend	300432
Falcon FACS Tubes	Becton Dickinson	352058
FCS	HyClone	SV30160.03
G418	Calbiochem	345810
German coverglass system 4 chamber slides	Lab-Tek II	155382
HCl	Bio Lab	8410501
Hepes	Biological Industries	03-025-1B
Hygromycin	Enzo	ALX-380-306
L-glutamine	Sigma	G7513
PBS (10X)	Sigma	D1408
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P0781
Poly-L-lysine 0.1% (w/v) in H2O	Sigma	P8920
RPMI	Sigma	R8758
Sodium azide	Sigma	S2002
Equipment
Accublock digital dry bath	Labnet	D1105A
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810 R
Confocal microscope	Zeiss	LSM 510 Meta
Heatable mounting frame – Heating Insert P S	PeCon	130-800-031
TempModule S (required for the heatable mounting frame)	Zeiss	411860-9010-000
Electroporation device	Amaxa	Nucleofector I
Fluorescence activated cell sorter	Becton Dickinson	FACSVantage SE
Image analysis software	Bitplane	7.0.0