Real-time Live avbildning av T-cellsignalering Complex Formation
Summary
Vi beskriver en live-cell imaging metod som ger en inblick i protein dynamik under T-cells aktivering process. Vi visar den kombinerade användningen av T-cell sprider analysen, konfokalmikroskopi och bildanalys för att ge kvantitativa resultat att följa signalering komplexbildning hela T-cell aktivering.
Abstract
Skydd mot infektionssjukdomar medieras av immunsystemet 1,2. T-lymfocyter är befälhavaren samordnare av immunförsvaret, reglerar aktivering och svar av flera immunceller 3,4. T-cells aktivering är beroende av erkännande av specifika antigener visas av antigenpresenterande celler (APC). Den T-cell-antigenreceptorn (TCR) är specifika för varje T-cellklon och bestämmer antigenspecificitet 5. Bindningen av TCR till antigenet inducerar fosforylering av komponenter i TCR-komplexet. I syfte att främja en T-cells aktivering, måste denna signal omvandlas från membranet till cytoplasman och kärnan, initiera olika viktiga reaktioner, såsom rekrytering av signalering proteiner till TCR, APC webbplats (immun synaps), deras molekylära aktivering, cytoskeletal omlagring, förhöjning av intracellulär kalcium koncentration, och förändringar i genuttryck 6,7. Den korrekta iitiation och uppsägning av aktiverande signaler är avgörande för lämpliga T-cells svar. Aktiviteten av signalproteiner är beroende av bildandet och avslutande av protein-proteininteraktioner, post translationella modifieringar såsom proteinfosforylering, bildning av proteinkomplex, protein ubiquitylation och rekryteringen av proteiner till olika cellulära platser 8. Förstå inre arbetet i T-cells aktivering process är avgörande för både immunologisk forskning och kliniska tillämpningar.
Olika analyser har utvecklats i syfte att undersöka protein-protein-interaktioner, men gör biokemiska analyser, såsom det ofta används co-immunoprecipitation metoden, inte tillåta protein plats att skönjas, vilket utesluter observation av värdefulla insikter om dynamiken i cellulära mekanismer. Dessutom dessa bulk analyser kombineras vanligen proteiner från många olika celler som kan vara i olika stadier av tHan undersökte cellulär process. Detta kan ha en skadlig effekt på tidsupplösning. Användningen av realtid avbildning av levande celler tillåter både den rumsliga spårning av proteiner och förmågan att tidsmässigt skilja mellan signalering händelser, alltså belysa dynamiken i processen 9,10. Vi presenterar en metod för realtid avbildning av signalering-komplexbildning under T-cells aktivering. Primära T-celler eller T-cellinjer, såsom Jurkat, transfekteras med plasmider som kodar för proteiner av intresse sammansmälta med monomera fluorescerande proteiner, hindrar icke-fysiologisk oligomerisation 11. Live T-celler sjönk under ett täckglas förbelagt med T-cell-aktiverande antikropp 8,9, som binder till CD3/TcR komplexet, inducera T-cells aktivering samtidigt undvika behovet av specifika aktiverande antigener. Aktiverade celler ständigt avbildas med hjälp av konfokalmikroskopi. Imaging data analyseras för att ge kvantitativa resultat, såsom colocalization koefficient för de signalproteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Regleringen och funktion av flera cellulära processer beror på bildandet och avslutande av protein-proteininteraktioner. Mikroskopisk bildbehandling gör det i realtid spårning av fluorescerande taggade proteiner i levande celler. Colocalization av märkta proteiner kan föreslå en direkt eller indirekt interaktion mellan proteinerna, och kan användas för att förstärka resultaten erhållna genom biokemiska metoder, såsom immunutfällning. Till skillnad biokemiska metoder, gör live-cell imaging dessa inter-prot…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Sophia Fried för tekniskt bistånd. MBS tackar följande myndigheter för deras forskningsstöd: The Israel Science Foundation för bidrag no.1659/08, 971/08, 1503-1508 och 491/10, ministerierna för Health & Science för bidrag inga. 3-4114 och 3-6540, Israel Cancer Association genom Estate av den sena Alexander Smidoda, och Taubenblatt Family Foundation för biomedicin excellence bidrag.
Materials
| Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa human T Cell nucleofector kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Anti CD3 (UCHT1 clone) | BioLegend | 300432 | |
| Falcon FACS Tubes | Becton Dickinson | 352058 | |
| FCS | HyClone | SV30160.03 | |
| G418 | Calbiochem | 345810 | |
| German coverglass system 4 chamber slides | Lab-Tek II | 155382 | |
| HCl | Bio Lab | 8410501 | |
| Hepes | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Hygromycin | Enzo | ALX-380-306 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| PBS (10X) | Sigma | D1408 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | |
| Poly-L-lysine 0.1% (w/v) in H2O | Sigma | P8920 | |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Equipment | |||
| Accublock digital dry bath | Labnet | D1105A | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta | |
| Heatable mounting frame – Heating Insert P S | PeCon | 130-800-031 | |
| TempModule S (required for the heatable mounting frame) | Zeiss | 411860-9010-000 | |
| Electroporation device | Amaxa | Nucleofector I | |
| Fluorescence activated cell sorter | Becton Dickinson | FACSVantage SE | |
| Image analysis software | Bitplane | 7.0.0 |
Referências
- Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
- Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
- Doherty, P. C. Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).
- Jager, D., Jager, E., Knuth, A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
- Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. The actin cytoskeleton in T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).
- Reicher, B., Barda-Saad, M. Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network. FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).
- Barda-Saad, M., et al. Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton. Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry A. 77, 733-742 (2010).
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).
- Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity. J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).
- Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).
- Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization. Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).
- Barda-Saad, M., et al. Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization. EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).
- Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. . Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).
