Tempo reale Imaging in diretta di cellule T Signaling formazione del complesso
Summary
Si descrive un metodo live-cell imaging che permette di comprendere dinamica della proteina durante il processo di attivazione delle cellule T. Dimostriamo l'utilizzo combinato della cellula T diffusione saggio, microscopia confocale e analisi di imaging per produrre risultati quantitativi di seguire segnalamento formazione di complessi durante l'attivazione delle cellule T.
Abstract
Protezione contro le malattie infettive è mediato dal sistema immunitario 1,2. Linfociti T sono coordinatori del master del sistema immunitario, regolando l'attivazione e risposte di molteplici cellule immunitarie 3,4. Attivazione delle cellule T dipende dal riconoscimento di antigeni specifici mostrata dalle cellule presentanti l'antigene (APC). Il recettore dell'antigene delle cellule T (TCR) è specifico per ogni clone di cellule T e determina specificità antigenica 5. Il legame del TCR all'antigene induce la fosforilazione di componenti del complesso TCR. Al fine di promuovere l'attivazione delle cellule T, questo segnale deve essere trasdotte dalla membrana al citoplasma e il nucleo, avviando varie risposte cruciali quali l'assunzione di proteine di segnalazione al TCR; sito APC (sinapsi immune), la loro attivazione molecolare, riarrangiamento del citoscheletro, elevazione della concentrazione intracellulare di calcio, e cambiamenti nell'espressione genica 6,7. La corretta initiation e la cessazione dei segnali di attivazione è di fondamentale importanza per le risposte delle cellule T del caso. L'attività delle proteine di segnalazione dipende la formazione e la terminazione di interazioni proteina-proteina, post traduzionali come fosforilazione proteica, formazione di complessi proteici, ubiquitinazione proteica e l'assunzione di proteine a vari siti cellulari 8. Comprendere il funzionamento interno del processo di attivazione delle cellule T è fondamentale sia per la ricerca immunologica e applicazioni cliniche.
Vari test sono stati sviluppati al fine di indagare le interazioni proteina-proteina, tuttavia, saggi biochimici, come ad esempio il metodo di co-immunoprecipitazione ampiamente utilizzato, non consentono posizione proteina di essere discerne, precludendo così l'osservazione di preziose informazioni sulla dinamica del cellulare meccanismi. Inoltre, questi test di massa di solito si combinano proteine da molte cellule diverse che potrebbero essere in diverse fasi di tindagò processo cellulare. Questo può avere un effetto negativo sulla risoluzione temporale. L'uso di immagini in tempo reale delle cellule vive permette sia il tracking spaziale delle proteine e la capacità di distinguere temporalmente tra eventi di segnalazione, che perde così in luce la dinamica del processo di 9,10. Presentiamo un metodo di imaging in tempo reale della formazione di segnalazione-complesso durante l'attivazione delle cellule T. T-cellule primarie o linee di cellule T, come Jurkat, vengono trasfettate con plasmidi codificanti per proteine di interesse fuse ad proteine fluorescenti monomeriche, impedendo oligomerizzazione non fisiologico 11. Diretta cellule T sono sceso sopra un coprioggetto pre-rivestite con cellule T attivante 8,9 anticorpo, che si lega al complesso CD3/TCR, indurre l'attivazione delle cellule T superando la necessità di antigeni attivatori specifici. Cellule attivate sono costantemente ripreso con l'uso della microscopia confocale. Dati di imaging vengono analizzati per produrre risultati quantitativi, quali il collecoefficiente ocalization delle proteine di segnalazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
La regolazione e la funzione di molteplici processi cellulari dipendono la formazione e la terminazione di interazioni proteina-proteina. L'imaging microscopico consente il tracciamento in tempo reale delle proteine fluorescenti tag nelle cellule viventi. Colocalizzazione di proteine marcate può suggerire una interazione diretta o indiretta tra le proteine, e può essere utilizzato per rafforzare i risultati ottenuti con metodi biochimici, come la immunoprecipitazione. A differenza dei metodi biochimici…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Sophia fritto per l'assistenza tecnica. MBS ringrazia i seguenti agenzie per il sostegno della ricerca: La Fondazione Israel Science per le sovvenzioni no.1659/08, 971/08 1503/08 e 491/10, i Ministeri della Salute e della Scienza per le sovvenzioni non. 3-4114 e 3-6540, la Israel Cancer Association attraverso la Tenuta del compianto Alexander Smidoda, e la Fondazione Famiglia Taubenblatt per la borsa di eccellenza Bio-medicina.
Materials
| Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa human T Cell nucleofector kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Anti CD3 (UCHT1 clone) | BioLegend | 300432 | |
| Falcon FACS Tubes | Becton Dickinson | 352058 | |
| FCS | HyClone | SV30160.03 | |
| G418 | Calbiochem | 345810 | |
| German coverglass system 4 chamber slides | Lab-Tek II | 155382 | |
| HCl | Bio Lab | 8410501 | |
| Hepes | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Hygromycin | Enzo | ALX-380-306 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| PBS (10X) | Sigma | D1408 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | |
| Poly-L-lysine 0.1% (w/v) in H2O | Sigma | P8920 | |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Equipment | |||
| Accublock digital dry bath | Labnet | D1105A | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta | |
| Heatable mounting frame – Heating Insert P S | PeCon | 130-800-031 | |
| TempModule S (required for the heatable mounting frame) | Zeiss | 411860-9010-000 | |
| Electroporation device | Amaxa | Nucleofector I | |
| Fluorescence activated cell sorter | Becton Dickinson | FACSVantage SE | |
| Image analysis software | Bitplane | 7.0.0 |
Referências
- Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
- Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
- Doherty, P. C. Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).
- Jager, D., Jager, E., Knuth, A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
- Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. The actin cytoskeleton in T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).
- Reicher, B., Barda-Saad, M. Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network. FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).
- Barda-Saad, M., et al. Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton. Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry A. 77, 733-742 (2010).
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).
- Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity. J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).
- Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).
- Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization. Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).
- Barda-Saad, M., et al. Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization. EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).
- Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. . Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).
