A transfecção de proteína de rato Lung

Resumo

Os ratinhos transgénicos ou vectores virais têm sido utilizados para aumentar a expressão de proteína dentro do pulmão. No entanto, estas técnicas são demoradas e tecnicamente desafiante e têm efeitos fora do alvo, que pode confundir os resultados. O protocolo de transfecção de proteínas utiliza um reagente de transfecção à base de lipidos e uma microsprayer ultrafina para entregar uniformemente proteína activa a células do pulmão.

Resumo

O aumento da expressão da proteína permite aos pesquisadores entender melhor o papel funcional desta proteína na regulação de processos biológicos fundamentais ^1. No pulmão, isto foi conseguido tipicamente através de abordagens genéticas que utilizam ratinhos transgénicos ^2,3 ou vectores virais ou não virais, que elevam os níveis de proteínas por meio de aumento da expressão do gene ^4. Os ratinhos transgénicos são dispendiosas e demoradas para a geração e a inserção aleatória de um gene de expressão do transgene ou crónica pode alterar o desenvolvimento normal dos pulmões e, portanto, limitar a utilidade do modelo de ^cinco. Enquanto transgénicos condicionais evitam os problemas associados com a expressão do gene crónica ^6, os transactivador (rtTA) tetraciclina ratinhos controlados reversa, que são utilizados para gerar a expressão condicional, desenvolver espontânea alargamento espaço de ar ^7. Tal como acontece com transgénicos, a utilização de vectores virais e não virais é caro ⁸ e pode provocar a dose drespostas inflamatórias ependent que confundem os resultados ⁹ e dificultar a expressão ^10. Além disso, a eficácia de doses repetidas são limitados por respostas imunes reforçadas ao vetor de ^11,12. Pesquisadores estão desenvolvendo adeno-associado vetores virais (AAV) que provocam menos inflamação e têm mais expressão dentro do pulmão ^13.

Usando β-galactosidase, apresentamos um processo para o aumento da expressão de proteínas rápida e eficazmente dentro do pulmão, usando uma técnica de transfecção directa de proteínas. Este protocolo de mistura uma quantidade fixa de proteína purificada com 20 ul de um reagente de transfecção à base de lípidos (Pro-Ject, Pierce Bio) para permitir a penetração no próprio tecido do pulmão. A mistura de proteína lipossomal é então injectado para dentro dos pulmões dos ratos através da traqueia usando uma microsprayer (Penn Century, Filadélfia, PA). O microsprayer gera uma multa nuvem de aerossol líquido ao longo dos pulmões. Usando a técnicademonstrámos deposição uniforme da proteína injectada ao longo das vias aéreas e alvéolos dos ratinhos ^14. A técnica de transfecção de lípidos permite o uso de uma pequena quantidade de proteína para alcançar o efeito. Isto limita a resposta inflamatória, que de outra forma seria provocada por administração da proteína. De fato, usando esta técnica nós publicamos que fomos capazes de aumentar significativamente a atividade PP2A no pulmão sem afetar pulmão celularidade do lavado ^15. Lavagem pulmonar celularidade feita 24 horas após o desafio foi comparável com os controlos (27 ± 4 Controlo vs 31 ± 5 transfectada albumina, N = 6 por grupo). Além disso, aumenta os níveis de proteína sem induzir mudanças de desenvolvimento do pulmão ou mudanças de arquitectura que pode ocorrer em modelos transgénicos. No entanto, a necessidade de administrações repetidas podem tornar esta técnica menos favorável para estudos examinando os efeitos dos aumentos a longo prazo na expressão da proteína. Isto seria particularmente true de proteínas com uma meia-vida curta.

Protocolo

1. Preparação de Proteína Reagente de Transfecção

1. Dissolve-se o reagente Pro-Ject por adição de 250 ul de metanol e clorofórmio, para o tubo contendo a película seca.
2. Vortex para 10-20 segundos a velocidade máxima.
3. Pipetar 20 ul de reagente Pro-Ject em tubos de microcentrífuga separados.
4. Evapora-se o solvente por meio de colocação dos tubos de microcentrífuga contendo o reagente Pro-Ject sob uma câmara de fluxo laminar durante um mínimo de 6 horas à temperatura ambiente. Ele deve estar completamente seca. Alternativamente, secar o reagente Pro-Ject usando um secador de vácuo.
5. Armazenar os tubos a -20 ° C. Eles são bo....

Resultados

Para demonstrar a eficácia da nossa técnica foi utilizada uma microsprayer (Penn Century) para injectar a traqueia de ratinhos com 2 mg de albumina de rato (Sigma) dissolvidos em 50 mL de PBS que continha 20 ul de reagente de transfecção Pro-Ject. Os ratinhos tratados com albumina foram comparados com os ratos que foram tratados de modo idêntico, com 2 ug de proteína de beta-galactosidase (Pierce Bio). Depois de vinte e quatro horas, os ratos foram sacrificados e os pulmões foram processados ​​para análise histoló.......

Discussão

A vantagem desta técnica em relação a outros métodos é que produz aumentos dos níveis de proteína e de actividade dentro do próprio tecido do pulmão. Além disso, ele penetra para as regiões distais do pulmão em vez de ficar apenas dentro das vias respiratórias. Nós medimos o aumento da atividade da proteína do nosso injetado mesmo depois lavaging as vias aéreas com soro fisiológico ^15. As análises de actividade de tecido indicam que a proteína é entrar nas células e não apenas permanecem nos espaços aéreos do.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pro-Ject	Pierce Bio	89850
Micropulverizador	Penn Century	FMJ-250
Beta-galactosidase	Pierce Bio	89850
Anticorpo Beta-galactosidase	Santa Cruz Bio	SC-19119
Albumina sérica de camundongo	Sigma Aldrich	A3139
Cetamina / xilazina	Sigma Aldrich	K113