Her beskriver vi en protokoll for samtidig påvisning av histonmodifikasjonene ved immunfluorescens og DNA-sekvenser av DNA fisk etterfulgt av 3D mikroskopi og analyser (3D immuno-DNA FISH).
Fluorescerende in situ hybridisering med DNA-prober på 3-dimensjonalt bevart kjerner etterfulgt av 3D konfokalmikroskopi (3D DNA FISH) representerer den mest direkte måten å visualisere plasseringen av genloci, kromosomal subregioner eller hele områder i enkeltceller. Denne typen analyse gir et innblikk i global arkitektur av kjernen så vel som virkemåten av spesifikke genomisk loci og regioner innenfor kjernefysiske plass. Immunfluorescens, på den annen side, tillater påvisning av kjernefysiske proteiner (modifiserte histoner, histone varianter og modifikatorer, transkripsjon maskiner og faktorer, kjernefysiske sub-avdelinger, etc). Den største utfordringen i å kombinere immunfluorescens og 3D DNA FISH er, på den ene side for å bevare epitopen detektert av antistoffet samt 3D arkitekturen av kjernen, og på den annen side, for å tillate inntrengning av DNA probe for å påvise genloci eller kromosom territorier 1-5. Her tilbyr vi en protokoll som kombinerer visualisering av kromatin modifikasjoner med genomisk loci i 3D bevart kjerner.
Epigenetic mekanismer utløser etablering og arv av utviklings-og celle-type spesifikke transkripsjonelle profiler. På ett nivå innebærer dette modulering av kromatin emballasje som definerer aktive eller stille genomisk regioner. I større målestokk, global 3D organisering av genomet og kjernefysisk arkitektur også spille en rolle i kontroll av transkripsjonelle mønstre. Dermed er disseksjon av disse epigenomic funksjoner avgjørende for en full forståelse av hvordan genene reguleres 6-11.
Kombinert immunfluorescens og 3D DNA FISH gir en unik mulighet til å utfylle biokjemiske og molekylærbiologiske analyser ved å vurdere konkrete interaksjoner / foreninger av DNA-sekvenser og / eller proteiner i kjernen. Videre, mens genom-wide høy gjennomstrømning teknikker som kromatin immunoutfelling (chip-seq) eller kromosom fangst konformasjon kombinert med dyp sekvensering (4C-seq, 5C, Hi-C) gi global data på cellepopulasjoner 12, immunofluorescence / DNA FISK teknikker gjør analyser på enkelt celle-nivå.
Her beskriver vi en protokoll for samtidig påvisning av histonmodifikasjonene ved immunfluorescens og DNA-sekvenser av DNA fisk etterfulgt av 3D mikroskopi og analyser (3D immuno-FISH). Fordelen med denne protokollen er den kombinerte visualisering av DNA og bevaring av proteinstrukturer. Vår erfaring på dette feltet har gitt oss mulighet til å forbedre og forenkle eksisterende protokoller. Selv om vi har brukt denne protokollen for å oppdage DNA dobbel-strandet pauser i lymfocytter gjennomgår rekombinasjon, kan denne metoden brukes på andre proteiner og andre celle-typer.
Teknikkene beskrevet ovenfor ble brukt i vårt laboratorium for å analysere reguleringen av V (D) J-rekombinasjon av immunoglobulin og Tcra / d loci i utviklingen lymfocytter 30,31. Vi er sikre på at denne teknikken kan tilpasses for påvisning av ulike kjernefysiske proteiner, kjernefysiske avdelinger og loci, i ulike celle-typer. Modifikasjoner av protokollen kan være nødvendig, og i dette tilfellet de viktigste trinnene å fokusere på er følgende. Først, kan lengden permeabilizatio…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke medlemmene av Skok lab, spesielt Susannah Hewitt, for diskusjoner og kommentarer. Dette arbeidet er støttet av National Institute of Health tilskudd R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS er en Leukemi og lymfom Society forsker. JC er en Irvington Institute Fellow ved Cancer Research Institute. MM er støttet av National Science Foundation Grant Integrative Graduate Utdannings-og forskningsdepartementet Praksisplass (NSF IGERT 0333389).
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
H2O | Fisher | # BP2470 | |
RNase A | Sigma | # R4642 | |
dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
DNase I | Roche | # 04536282001 | |
DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
Formamide | Fisher | # BP227 | |
Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
Slides | Fisher | # 12-550 | |
6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
Table 1. Specific reagents and small equipment. |