वृषण सेल निलंबन की तैयारी के लिए सरल और कारगर तकनीक
Summary
एंजाइमों और डिटर्जेंट से बचने कृंतक सामग्री से वृषण सेल निलंबन, के यांत्रिक तैयारी के लिए एक उपन्यास प्रोटोकॉल में वर्णित है. विधि बहुत सरल, तेज, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और प्रवाह छँटाई और शाही सेना निकासी के लिए उपयुक्त हैं, जो अच्छी गुणवत्ता सेल निलंबन, renders.
Abstract
स्तनधारी वृषण दैहिक वृषण कोशिकाओं और germline कोशिकाओं के विभिन्न चरणों सहित 30 से अधिक विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के होते हैं कि बहुत जटिल अंग हैं. इस विविधता शुक्राणु विकास के कुछ चरणों में शुद्ध या समृद्ध सेल आबादी सबसे आणविक विश्लेषण 1 के लिए आवश्यक हैं, के रूप में स्तनधारी शुक्राणुजनन के ठिकानों के अध्ययन के विषय में एक महत्वपूर्ण कमी है.
ऐसे Staput 2,3, केन्द्रापसारक धावन 1, और प्रवाह के रूप में विभिन्न रणनीतियों (एफसी) 4,5 अंतर जीन अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए सक्षम करने के क्रम में समृद्ध या शुद्ध वृषण सेल आबादी प्राप्त करने के लिए नियोजित किया गया है.
यह कोशिकाओं सबसे संवर्धन / शुद्धि दृष्टिकोण के लिए निलंबन में हैं कि आवश्यक है. आदर्श रूप में, सेल निलंबन मूल ऊतक के प्रतिनिधि होंगे, व्यवहार्य कोशिकाओं और कुछ multinucleates की एक उच्च अनुपात है – क्योंकि के रूप में करते हैं जोऔर कमी सेल clumps 1 – बीजदार उपकला 6,7 की syncytial प्रकृति. पिछली रिपोर्टों से एक विशेष रूप से यांत्रिक विधि से तैयार वृषण सेल निलंबन trypsinized वाले 1 से अधिक आसानी से clumped कि इसका सबूत था. RNases और / या trypsin और कुछ बहाव के अनुप्रयोगों के लिए अवांछनीय है जो विशिष्ट अणुओं गिरावट, को collagenase नेतृत्व तरह disaggregating एंजाइमों के साथ दूसरी ओर, एंजाइमी उपचार. आदर्श प्रक्रिया ऐसी mRNAs के रूप में ब्याज के अणुओं का एक अच्छा संरक्षण प्राप्त करने के लिए इतनी के रूप में संभव के रूप में कम हो सकता है और न्यूनतम हेरफेर को शामिल करना चाहिए. ठोस ऊतकों से सेल निलंबन की तैयारी के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल आमतौर पर समय लेने वाली है, अत्यधिक ऑपरेटर पर निर्भर हैं, और चुनिंदा कुछ सेल प्रकार 1,8 नुकसान हो सकता है.
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक साथ एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और अत्यंत संक्षिप्त यांत्रिक disaggregation के लाभों को जोड़ती हैप्रवाह cytometric विश्लेषण और छँटाई 4, और गुप्त जीन अभिव्यक्ति पढ़ाई 9 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि अच्छी गुणवत्ता सेल निलंबन के लिए अग्रणी एंजाइमी उपचार के bsence,.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित अनुकूलित विधि एंजाइम और डिटर्जेंट उपचार से बचने और अच्छा सेल अखंडता और प्रकार के अनुपात को बनाए रखने, एक बहुत तेजी से और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रास्ते में कृंतक वृषण ऊतक से सेल निलं?…
Acknowledgements
इस काम आंशिक रूप से CSIC (मैं + डी परियोजना C022) और PEDECIBA द्वारा समर्थित किया गया था. लेखकों धीरे इस परियोजना में इस्तेमाल गिनी पिग नमूने उपलब्ध कराने के लिए MoFlo सेल सॉर्टर, और Merial-मोंटेवीडियो के विषय में उनके उदार सहयोग के लिए सेल बायोलॉजी यूनिट (Institut पाश्चर डे मोंटेवीडियो) से Mariela Bollati और वेलेंटीना पोरो धन्यवाद देना चाहता हूँ. चित्रा 1 आंकड़े 2 और 3, और एस Karger एजी, बेसल की अनुमति के साथ तालिका 1, Biomed मध्य की अनुमति के साथ reproduced किया गया था और आंकड़े 4 और 5 जॉन विले एंड संस, इंक (के स्वामित्व कॉपीराइट की अनुमति के साथ reproduced या रूपांतरित किया गया विले- ब्लैकवेल, 2011).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
Referências
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