Une méthode simple pour enregistrer les potentiels de champ extracellulaires dans le cerveau antérieur larvaire du poisson zèbre est décrite. La méthode fournit une robuste<em> In vivo</em> Lecture de saisie-comme l'activité. Cette technique peut être utilisée avec poisson zèbre génétiquement modifié portant des gènes liés à l'épilepsie ou de convulsions provoquées par l'administration de médicaments anticonvulsivants.
L'épilepsie touche près de 3 millions de personnes aux Etats-Unis et jusqu'à 50 millions de personnes à travers le monde. Définie comme la survenue de crises non provoquées spontanées, l'épilepsie peut être acquise à la suite d'une insulte au cerveau ou une mutation génétique. Les efforts de crises modèle chez l'animal ont principalement utilisé acquise insultes (médicaments anticonvulsivants, la stimulation ou une lésion cérébrale) et les manipulations génétiques (knockdown antisens, la recombinaison homologue ou transgénèse) chez les rongeurs. Le poisson zèbre constituent un système modèle vertébré 1-3 qui pourrait fournir une alternative intéressante aux rongeurs à base de recherche sur l'épilepsie. Le poisson zèbre sont largement utilisés dans l'étude de la génétique des vertébrés ou de développement, présentent un degré élevé de similitude génétique des mammifères et d'exprimer homologues pour environ 85% des mutations connues de l'homme épilepsie d'un seul gène. En raison de leur petite taille (4-6 mm de longueur), les larves de poisson zèbre peut être maintenu dans des volumes de fluide aussi bas que 100 pi au cours du développement précoce et arrayed en plaques multi-puits. Les réactifs peuvent être ajoutés directement à la solution dans laquelle les embryons se développent, ce qui simplifie l'administration du médicament et permettant une réaction rapide criblage in vivo de composés d'essai 4. Oligonucléotides synthétiques (morpholinos), mutagénèse, de zinc et de nucléases doigt approches transgéniques peut être utilisé pour générer rapidement démontable ou mutation du gène chez le poisson zèbre 5-7. Ces propriétés payer les études de poisson zèbre sans précédent avantage de pouvoir sur l'analyse statistique des rongeurs dans l'étude des troubles neurologiques comme l'épilepsie. Parce que le «gold standard» pour la recherche en épilepsie est de surveiller et d'analyser les rejets anormaux électriques qui prennent naissance dans une structure du cerveau central (c.-à-crises d'épilepsie), une méthode efficace pour enregistrer l'activité cérébrale chez les larves du poisson zèbre est décrite ici. Cette méthode est une adaptation de techniques classiques d'enregistrement extracellulaire et permet un fonctionnement stable à long terme de surveillance de l'activité cérébrale chez les larves de poisson zèbre intacte. Senregistrements amples sont présentés pour les crises aiguës induites par l'application de médicaments convulsivants bain et saisies spontanées enregistrées dans un poisson génétiquement modifié.
La méthode d'enregistrement extracellulaire présentée ici permet une analyse très sensible et rapide de l'activité cérébrale. Ces enregistrements sont analogues à électroencéphalographique (EEG) de surveillance couramment utilisé pour évaluer la présence de décharges électriques anormales (par exemple, la saisie) dans des modèles rongeurs d'épilepsie 11 et les patients de 12. Enregistrements extracellulaires peuvent être combinés avec des manipulations pharma…
The authors have nothing to disclose.
L'auteur tient à remercier Peter Castro et Matthew Dinday pour leurs premiers efforts pour mettre en place le poisson zèbre dans le laboratoire. Ce travail a été financé par le National Institutes of Health EUREKA subvention (# R01NS079214-01).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Agarose low melting | Fisher-Scientific | BP1360-100 | Dissolve in embryo media at 1.2% |
Recording media | Fisher-Scientific | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH |
Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
α-bungarotoxin | Tocris Bioscience | 2133 | 1 mg/ml |
Capillary glass tubing | Warner Instruments | G120TF-3 | Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
Patch clamp amplifier | Warner Instruments | PC-505B | We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions. |
Filter/amplifier | Cygnus Technology | FLA-01 | We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions. |
Axon A/D board and Axoscope software | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 | Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 kHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer’s instructions. |
Egg water | Instant Ocean | 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water |