Denne protokol beskriver metoden til gen fælde insertionsmutagenese hjælp Gal4-VP16 som den primære reporter og GFP / RFP som sekundære journalister i zebrafisk. Omkring én ud af ti højt udtrykker F0 fisk udbytte gen afkom fælde co-udtrykker GFP og RFP. Screeningsproceduren kan let skaleres til at tilpasse størrelsen af det laboratorium, der udfører den insertionsmutagenese skærmen.
Store kobling størrelse og ekstern udvikling af optisk transparente embryoner zebrafisk en ekstraordinær hvirveldyr model for in vivo insertionsmutagenese hjælp fluorescerende reportere at mærke ekspression af muterede gener. Adskillige laboratorier har konstrueret og testet forstærker-og gen-trap-vektorer i zebrafisk, ved hjælp af fluorescerende proteiner, Gal4-og lexA-baserede transskriptionsaktivatorer som journalister 1-7. Disse vektorer havde to potentielle ulemper i form af suboptimal stringens (f.eks manglende evne til at skelne mellem forstærker-og gen-trap begivenheder) og lav mutagenicitet (f.eks integrationer til gener sjældent produceret null alleler). Gene Breaking Transposon (GBTs), blev udviklet til at løse disse ulemper 8-10. Vi har ændret et af de første GBT vektorer GBT-R15, til brug med Gal4-VP16 som den primære gen fælde reporter og tilføjede UAS: eGFP som det sekundære reporter for direkte påvisning af gen-trap begivenheder. Anvendelsen af Gal4-VP16 som den primære gen fælde reporter giver to store fordele. For det første øger følsomheden for gener udtrykt ved lave udtryk niveauer. For det andet, at forskerne kan bruge gen fælde linjer Gal4 chauffører direkte udtryk for andre transgener i meget specifikke væv. Dette er især relevant for gener med ikke-essentielle eller overflødige funktioner, hvor gen fælde integration kan ikke resultere i åbenlys fænotyper. Ulempen ved at bruge Gal4-VP16 som den primære gen fælde reporter er, at gener, der koder for proteiner med N-terminale signalsekvenser er ikke modtagelig for fældefangst, som sandsynligvis ikke vil være i stand til at trænge ind i kernen de resulterende Gal4-VP16 fusionsproteiner og aktivere transkription. Vigtigere er det, at anvendelsen af Gal4-VP16 ikke forvælge for kerneproteiner: vi genvundet gen trap mutationer i gener, der koder for proteiner, der fungerer i kernen, cytoplasmaet og plasmamembranen.
Insertionsmutagenese har vist sig at være en kraftfuld metode til at dissekere genfunktion i forskellige modelsystemer fra encellede organismer som bakterier og gær til flercellede organismer, såsom mus og planter. Enhver exogene DNA (virus, transposon eller plasmid), kan tjene som et mutagen ved at afbryde væsentlige elementer af gener såsom exons eller promotorer. Den effektive mål for sådanne enkle metoder er overordentlig lille i store komplekse genomer, da exons udgør kun 1-3% af en typisk hvirveldyr genom. Lille effektiv mål størrelse kan overvindes ved meget høj vektor integration satser, som eksemplificeret ved den enorme succes retroviral insertionsmutagenese i zebrafisk 11,12. I modsætning hertil introner omfatter omkring 20-30% af hvirveldyr genomer. I zebrafisk, transposon-baserede insertionsmutagenese vektorer, der effektivt indføre nul-eller svære hypomorphic mutationer på en integration i introns har fået navnet "gen bryde transposons "(GBTs) 8-10. Til effektiv gen fælde integration, de bruger en minimal Tol2 transposon 13,14. Mutagenicitet af GBTs afhængig fiske-afledte splejsningsacceptor og transkriptionstermineringssekvenser / polyadenyleringssekvenser. Elementerne er ansvarlige for GBT mutagenicitet flankeres ved direkte loxP sites for excision af Cre rekombinase. Således injektion af Cre mRNA fører til en effektiv reversion af GBT-inducerede mutationer, selv om nogle transposonsekvenser forbliver på integrationen locus 9,10.
De nyligt offentliggjorte GBT vektorer bruger mRFP som genet fælde reporter 9,10, hvilket fører til to potentielle mangler. For det første er det ikke vidst, hvad brøkdel af zebrafisk gener er udtrykt på et højt nok niveau til at blive opdaget af direkte fluorescerende reporter fusionsproteiner. For det andet er det kun en lille delmængde af gener, der forventes at have væsentlige funktioner. Det er blevet anslået, at der kun er 1,400-2,400 gener kræves for zebrafisk development 15,16. De fleste gen trap mutanter forventes ikke at vise åbenlyse fænotyper og vil derfor have begrænset nytte. For at overvinde disse to begrænsninger, har vi modificeret GBT-R15 9,10 til brug med Gal4-VP16 som den primære gen fælde reporter (Balciuniene et al. Under udarbejdelse). Som med Aug-mindre mRFP i GBT-R15 blev translationsstartstedet fjernet fra Gal4-VP16. Til direkte påvisning af gen-trap begivenheder vore vektorer indeholder en eGFP reporter under kontrol af 14x Gal4 UAS 17,18.
Flere ekstra funktioner er udviklet i vores todelte genfældevektoren. UAS'et: eGFP kassetten er flankeret af direkte FRT sites (grå vinkler i figur 1). Injektion af Flp recombinase mRNA fører til udtagelse af UAS: eGFP kassette, forlader gen fælde mutation umærket af eGFP fluorescens. Det kan derefter anvendes i transgene linier, der markerer specifikke væv eller udviklingsmæssige begivenheder ved GFP-fluorescens. Som i andreGBTs er hele genet fælde kassette flankeret af direkte loxP sites (åbne femkanter i figur 1). Dette gør gen fælde begivenheder reversibel ved ekspression af Cre rekombinase, let at opnå bevis for kausalitet mellem en bestemt gen fælde integration og observerede fænotype (figur 2). Endelig genet fælde kassette flankeret af inverterede I-Scel meganuclease sites (sorte trekanter i figur 1). I Drosophila er transposonsekvenser integrationer ofte konverteres til sletninger (mangler) ved upræcis udskæring af P-element. Der er ingen beviser for, at excision af Tol2 transposon (eller enhver anden transposon aktiv i hvirveldyr såsom Tornerose, PiggyBac eller Ac / Ds), kan føre til sletninger. Vi inkluderede derfor I-SCEI sites som en potentiel surrogat metode til induktion af sletninger, selvom der ikke er noget bevis for, at I-Scel kan fremkalde sletninger i zebrafisk. Det skal bemærkes, at mens I-Scel meganuclease kan anvendes til at lette gensplejsning i zebrafisk, er DNA-spaltning af I-Scel meganuclease anvendes til at undersøge DNA-reparation mekanismer, herunder fejlbehæftet ikke-homolog ende sammenføjning, i gær og mammale celler 19-22.
Integration af vores genfældevektoren kan føre til eGFP ekspression af to forskellige mekanismer. Den første er en sand gen fælde begivenhed (Figur 1C): vektoren integreres i et gen (IMG for Insertionally muterede gen), en fusion afskrift mellem 5 'af endogene IMG udskrift og Gal4-VP16 er lavet og omsættes til en fusionsprotein indeholdende den N-terminale ende af proteinet kodet af IMG og Gal4-VP16. Dette fusionsprotein binder til 14x UAS og aktiverer transkription af eGFP. Den anden, mindre ønskeligt begivenhed er en enhancer trap (figur 1D): Den minimale promotor foran eGFP falder under kontrol af en forstærker i nærheden af integration site, der fører til produktion af eGFP i abmeget af Gal4-VP16 produktion. I vores estimat 30-50% af eGFP udtryksbegivenheder skyldes en enhancer fælde og 50-70% skyldes et gen trap 23 (Balciuniene et al. Under udarbejdelse). For at skelne mellem disse to klasser af begivenheder, har vi lavet en 14xUAS: mRFP transgene linie (figur 1B), for nemheds skyld præget af linse-specifik γCry: (. Balciuniene m.fl. under udarbejdelse) GFP. Gene fælde begivenheder er verificerede af co-ekspression af GFP og RFP (sammenlign C og D i figur 2).
I vores pilot skærmen, har vi genvundet over 40 gen trap begivenheder efter screening 270 F0 fisk injiceret med en blanding af transposon-DNA og transposase mRNA. To af vores gen fælde integrationer er forekommet i gener med tidligere publicerede kemisk inducerede mutanter: NSF og FLR. De fænotyper af vores insertionelle mutanter NSF tpl6 og flr tpl24 er overfladisk skelnes fra fænotypes af de tilsvarende kemisk inducerede mutanter. Vi bemærkede også, at gen-trap hændelser vises forspændt mod introns nær 5'-enden af gener, hvilket øger sandsynligheden for null alleler. Vi gør observere en vis grad af UAS lyddæmpning (variegation) i alle vores gen fælde linjer, og nogle loci er klart mere modtagelige for variegation end andre. Vi tror ikke, at UAS lyddæmpning er et væsentligt problem for opformering af genet fælde linjer, som vi har været i stand til nemt udbrede alle vores gen fælde linjer gennem mindst fem generationer ved at selektere for GFP udtryk alene.
Genet fælde vektorer og metoder er beskrevet her, bliver allerede brugt i flere uafhængige laboratorier. Det er vores erfaring, er der to kritiske trin i processen. Det første afgørende skridt er at opnå høje gen fælde integration i injicerede F0 embryoner. Svigt på dette trin kan ofte tilskrives RNase forurening af injektion reagenser, især miniprep DNA. Det er også meget vigtigt at injicere embryoner ved 1 cellestadiet til gen-trap-eksperimenter. Det er vores erfaring, Tol2-medieret transgenese er meget effektiv, hvilket gør det muligt at opnå transgene linier, selv når indsprøjtning senest den 1. celle scenen eller med lavere kvalitet DNA. Deklasserede injektioner er langt mere problematisk, når de udfører gen fælde mutagenese, da kun en lille brøkdel af vektor integrationer resulterer i effektive gen trap begivenheder. Det andet afgørende skridt er at fastslå gen fælde begivenheder ved at krydse vores UAS: mRFP linje. Fravær af mRFP udtryk ernæsten altid indikativ for en enhancer trap begivenhed. Men nogle gange manglende mRFP udtryk kan indikere undertrykkelse af de 14x UAS. Det er derfor vigtigt at fastholde UAS: mRFP linje i en ikke-lyddæmpet tilstand ved at udbrede næste generation bruger personer med høj RFP udtryk, når krydset til NSF tpl6.
Vi kan forudse at gøre flere forbedringer i vores gen fælde vektorer og protokol. Den første er at anvende en mindre gentagne UAS i genet fælde konstruktion. Det er blevet vist, at en 5x UAS er tilstrækkeligt til at opnå fuld aktivering i celle kultur eksperimenter, og at mindre repetitive UAS-sekvenser er mindre modtagelige for methylering og silencing 6,25. Det kan også være muligt at designe gen fælde vektorer for fuldt betinget mutagenese i lighed med de vektorer, der anvendes af det internationale musegen fælde konsortium og for nylig tilpasset til zebrafisk 2,26,27. En anden forbedring ville være at anvende en anden transposon, for eksempel Sleeping Beauty 28 at generere en UAS: mRFP reporter linje. Dette ville give injektion af Tol2-baserede gen fælder direkte ind i reporter linje og screening af F0s ved incrossing. Desuden vil det eliminere brugen af to forskellige genetiske baggrunde, hvilket gør fortolkningen af tab af funktion fænotyper mere ligetil. Selv med disse forbedringer, vil den generelle Gal4 gen fælde protokol præsenteres her stadig være fuldt ud gældende.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Jennifer Emtage for kritisk læsning af manuskriptet, Ryan Gill til teknisk bistand og hjælp med zebrafisk omhu og Dr. Stephen C. Ekker (Mayo Clinic, Rochster, Minnesota) reagenser. Vores arbejde er blevet støttet af Temple University College for Videnskab og Teknologi og National Institutes of Health (R01-HD061749).
Name of the Reagent/Material | Company | Catalog # | Comments |
Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Optional PB wash step is a must |
XbaI restriction enzyme | ThermoFisher | ER0681 | |
mMessage Machine T3 | Ambion | AM1348 | |
RiboLock RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
RNeasy MinElute | Qiagen | 74204 | Can be replaced by phenol extraction and precipitation. Do not use LiCl! |
Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | Has to be non-DEPC treated |
Borosilicate glass capiliaries for microinjection needles | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Microcapiliaries for calibration | Drummond Scientific | 1-000-0010 | |
Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
Needle puller * | Sutter Instruments | P-87 | |
Stereomicroscope for microinjection * | Nikon | SMZ1500 | We also use Wild 5M and Olympus SZ61 with transmitted light stand |
Picoinjector * | Harvard Instruments | Pli-90 | We also use Pli-100 |
Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Zeiss | Zeiss AxioImager | 5X Fluar objective has sufficient working distance |
Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Nikon | SMZ1500 | |
* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available. |