Denne protokollen beskriver metoden av genet felle innsettingen mutagenese ved hjelp Gal4-VP16 som den primære reporter og GFP / RFP som sekundære journalister i sebrafisk. Omtrent én av ti high-uttrykke F0 fisk avkastning genet felle avkom co-uttrykker GFP og RFP. Screeningfremgangsmåten kan lett skaleres til å tilpasse seg størrelsen på laboratoriet utfører innsettingen mutagenese skjermen.
Stor kullstørrelse og ekstern utvikling av optisk gjennomsiktig embryo gjør sebrafisk en eksepsjonell virveldyr modellsystem for in vivo innsettingen mutagenese ved hjelp av fluorescerende journalister å tagge uttrykk av muterte gener. Flere laboratorier har konstruert og testet enhancer-og gen-felle vektorer i sebrafisk, ved hjelp av fluorescerende proteiner, Gal4-og Lexa-baserte transkripsjonsaktivatorer som journalister 1-7. Disse vektorene hadde to mulige ulemper: suboptimal stringens (f.eks manglende evne til å skille mellom enhancer-og gen-felle hendelser) og lav mutagenisitet (f.eks integrasjoner i genene sjelden produsert null alleler). Gene Breaking transposon (GBTs) ble utviklet for å møte disse ulempene 8-10. Vi har modifisert av en av de første GBT vektorer, GBT-R15, for bruk med Gal4-VP16 som den primære genet felle reporter og lagt UAS: eGFP som sekundær reporter for direkte påvisning av genet felle arrangementer. Application av Gal4-VP16 som den primære genet felle reporter gir to fordeler. Først, det øker følsomheten for gener uttrykt på lave nivåer. For det andre gjør det forskere å bruke genet felle linjer som Gal4 drivere til direkte uttrykk for andre transgener i svært spesifikke vev. Dette er spesielt relevant for gener med ikke-essensielle eller overflødige funksjoner der genet felle integrering ikke kan resultere i overt fenotyper. Ulempen ved å bruke Gal4-VP16 som den primære genet felle reporter er at gener som koder for proteiner med N-terminal signalsekvenser er ikke mottagelig for fangst, som de resulterende Gal4-VP16 fusjonsproteiner er trolig ikke være i stand til å gå inn i cellekjernen og aktivere transkripsjon. Viktigere er bruken av Gal4-VP16 ikke pre-selektere for kjerneproteiner: vi gjenvunnet genet felle mutasjoner i gener som koder for proteiner som virker på kjernen, cytoplasma og plasmamembranen.
Innsettingen mutagenese har vist seg å være en kraftig tilnærming til dissekere gen-funksjon i ulike modellsystemer fra encellede organismer som bakterier og gjær til flercellede organismer som mus og planter. Enhver eksogen DNA (virus, transposon eller plasmid) kan tjene som et mutagen ved å avbryte vesentlige deler av gener som eksoner eller promotorer. Den effektive målet for slike enkle metoder er meget små i store komplekse genomer, for eksoner omfatter bare 1-3% av en typisk virveldyr genom. Liten effektiv målet størrelse kan overvinnes ved svært høy vektorintegrasjons priser, eksemplifisert ved den enorme suksessen til retrovirale innsettingen mutagenese i sebrafisk 11,12. I motsetning til dette introner omfatter omtrent 20 til 30% av hvirvel-genomer. I sebrafisk, transposon basert innsettingen mutagenese vektorer som effektivt innføre null-eller alvorlige hypomorphic mutasjoner ved integrering i introner har fått navnet "genet bryte transposons "(GBTs) 8-10. For effektiv genet felle integrering, de bruker en minimal Tol2 transposon 13,14. Mutagenisitet av GBTs er avhengig av fisk-avledet spleise akseptor og transkripsjons oppsigelse / polyadenylerings sekvenser. Elementene som er ansvarlige for GBT mutagenisitet er flankert ved direkte loxP nettsteder for eksisjon av Cre recombinase. Dermed injeksjon av Cre mRNA fører til effektiv tilbakeføring av GBT-induserte mutasjoner, selv om noen transposon sekvenser ligge på integrering locus 9,10.
De nylig publiserte GBT vektorer bruke mRFP som genet felle reporter 9,10, noe som fører til to potensielle svakheter. For det første er det ikke kjent hvilken del av sebrafisk gener uttrykkes på et høyt nok nivå til å bli detektert ved direkte fluorescerende reporter fusjonsproteiner. For det andre, blir bare en liten del av gener som forventes å ha viktige funksjoner. Det har blitt anslått at det bare er 1,400-2,400 gener som kreves for sebrafisk Nymcnt 15,16. De fleste genet felle mutanter er ikke forventet å vise åpenlys fenotyper og derfor vil ha begrenset nytte. For å overvinne disse to begrensninger, har vi endret GBT-R15 9,10 å bruke med Gal4-VP16 som den primære genet felle reporter (Balciuniene et al. Under forberedelse). Som med august-mindre mRFP i GBT-R15, ble oversettelsen startwebstedet fjernet fra Gal4-VP16. For direkte påvisning av genet felle hendelser, våre vektorer inneholde en eGFP reporter under kontroll av 14x Gal4 UAS 17,18.
Flere andre funksjoner er manipulert inn i vår bipartite genet felle vektor. UAS: eGFP kassett er flankert av direkte FRT nettsteder (grå Sparrer i figur 1). Injeksjon av Flp recombinase mRNA fører til eksisjon av UAS: eGFP kassett, forlater genet felle mutasjon umarkert ved eGFP fluorescens. Det kan da brukes i transgene linjer som markerer bestemte vev eller utviklings hendelser ved GFP fluorescens. Som i andreGBTs, er hele genet felle kassett flankert av direkte loxP sider (åpne pentagoner i figur 1). Dette gjør genet felle hendelser reversibel ved ekspresjon av Cre rekombinase, lett etablere bevis på årsaksforholdet mellom et bestemt gen felle integrering og observert fenotype (Fig. 2). Til slutt, er det genet felle kassett flankert av inverterte I-SCEI meganuclease sider (svarte trekanter i figur 1). I Drosophila, er transposon integrasjoner ofte konvertert til slettinger (mangel) ved upresis excision av P element. Det er ingen bevis for at eksisjon av Tol2 transposon (eller hvilken som helst annen transposon aktiv i virveldyr som Sleeping Beauty, PiggyBac eller Ac / Ds) kan føre til sletting. Vi følger derfor I-SCEI nettsteder som en potensiell surrogat metode for induksjon av slettinger, selv om det ikke er noen bevis på at jeg-SCEI kan indusere slettinger i sebrafisk. Det bør bemerkes at mens jeg-SCEI meganuklease kan brukes for å lette transgenesis i zebrafisk, blir DNA-spalting av I-SCEI meganuclease brukes til å studere DNA-reparasjonsmekanismene, herunder utsatt for feil ikke-homolog ende sammenføyning, i gjær-og pattedyrceller 19-22.
Integrering av vår genet felle vektor kan føre til eGFP uttrykk ved to forskjellige mekanismer. Den første er en sann gen felle arrangement (figur 1C): vektoren integreres i et gen (IMG for Insertionally muterte genet), en fusjon transkripsjon mellom 5 'av det endogene IMG transkripsjon og Gal4-VP16 er laget og oversatt til en fusjonsprotein som inneholder den N-terminus av proteinet kodet for av IMG og Gal4-VP16. Dette fusjonsprotein binder til den 14x UAS og aktiverer transkripsjon av eGFP. Den andre, mindre ønskelig hendelse er en enhancer-felle (fig. 1D): den minimale promoter foran eGFP faller under kontroll av en enhancer ved integrering side, som fører til produksjon av eGFP i abfølelse av Gal4-VP16 produksjon. I vår anslag, 30-50% av EGFP uttrykk arrangementer er på grunn av en enhancer felle og 50-70% er på grunn av et gen-felle 23 (Balciuniene et al. Under forberedelse). For å skille mellom disse to klasser av hendelser, har vi gjort en 14xUAS: mRFP transgen linjen (figur 1B), for enkelhets preget av linse-spesifikke γCry: (. Balciuniene et al i forberedelse) GFP. Gene felle hendelser er verifisert av co-uttrykk for GFP og RFP (sammenligne C og D i figur 2).
I vår pilotskjermen, vi gjenvunnet over 40 genet felle hendelser etter screening 270 F0 fisk injisert med en blanding av transposon DNA og transposase mRNA. To av våre genet felle integrasjoner har skjedd i gener med tidligere publiserte kjemisk-indusert mutanter: NSF og FLR. De fenotyper av vår innsett mutanter NSF tpl6 og flr tpl24 er overfladisk skilles fra fenotypes av de tilsvarende kjemisk-indusert mutanter. Vi observerte også at genet felle hendelser vises forspent mot introner nær 5 'enden av genene, og dermed øker sannsynligheten for null-alleler. Vi gjør observere en viss grad av UAS stanse (variegation) i alle våre genet felle linjer, og noen loci er klart mer utsatt for vekslande enn andre. Vi tror ikke at UAS lyddemping er et betydelig problem for spredning av genet felle linjer, som vi har vært i stand til enkelt å forplante alle våre genet felle linjer gjennom minst fem generasjoner ved å velge for GFP uttrykk alene.
Genet felle vektorer og metodikk som er beskrevet her brukes allerede i flere uavhengige laboratorier. I vår erfaring, er det to kritiske trinn i prosessen. Den første kritiske trinnet er å oppnå høy forekomst av genet felle integrering i injisert F0 embryoer. Svikt på dette trinnet kan ofte tilskrives RNase forurensning av injeksjons reagenser, spesielt miniprep DNA. Det er også meget viktig å injisere embryoer ved en cellestadiet for genet felle eksperimenter. I vår erfaring, er Tol2-mediert transgenesis svært effektiv, noe som gjør det mulig å få transgene linjer selv når injisere senere enn en celle scenen eller med lavere kvalitet DNA. Substandard injeksjoner er mye mer problematisk når man utfører genet felle mutagenese, siden bare en liten brøkdel av vektorintegras resultere i effektive genet felle arrangementer. Den andre kritiske trinnet er å fastslå genet felle hendelser ved krysset til vår UAS: mRFP linje. Fravær av mRFP uttrykk ernesten alltid en indikasjon på en enhancer-felle event. Men noen ganger mangel på mRFP uttrykk kan tyde stanse av de 14x UAS. Det er derfor viktig å opprettholde de UAS: mRFP linje i et ikke-Silenced tilstand ved å spre den neste generasjonen bruker personer med høy RFP uttrykk når krysset til NSF tpl6.
Vi kan forutse å gjøre flere forbedringer til våre genet felle vektorer og protokoll. Den første er å bruke en mindre repeterende UAS i genet felle konstruere. Det har vist seg at en 5 x UAS er tilstrekkelig for å oppnå fullstendig aktivering i cellekultur eksperimenter, og at mindre repetitive sekvenser UAS er mindre utsatt for metylering og stanse 6,25. Det kan også være mulig å utforme genet felle vektorer for fullt betinget mutagenese, i analogi til de vektorer som brukes av den internasjonale mus genet felle konsortiet og nylig tilpasset for sebrafisk 2,26,27. En annen forbedring ville være å bruke en annen transposon system, for eksempel Tornerose 28, for å generere et UAS: mRFP reporter linje. Dette ville gjøre det mulig injeksjon av Tol2-baserte genet feller direkte inn reporteren linje og screening av F0s ved incrossing. Videre vil dette eliminere bruken av to ulike genetiske bakgrunn, noe som gjør tolkningen av tap av funksjon fenotyper mer ukomplisert. Selv med disse forbedringene, ville den generelle Gal4 genet felle protokoll som presenteres her fortsatt være fullt brukbar.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Jennifer Emtage for kritisk lesing av manuskriptet, Ryan Gill for teknisk assistanse og hjelp med sebrafisk omsorg og Dr. Stephen C. Ekker (Mayo Clinic, Rochster, Minnesota) for reagenser. Vårt arbeid har vært støttet av Temple University College of Science and Technology og National Institutes of Health (R01-HD061749).
Name of the Reagent/Material | Company | Catalog # | Comments |
Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Optional PB wash step is a must |
XbaI restriction enzyme | ThermoFisher | ER0681 | |
mMessage Machine T3 | Ambion | AM1348 | |
RiboLock RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
RNeasy MinElute | Qiagen | 74204 | Can be replaced by phenol extraction and precipitation. Do not use LiCl! |
Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | Has to be non-DEPC treated |
Borosilicate glass capiliaries for microinjection needles | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Microcapiliaries for calibration | Drummond Scientific | 1-000-0010 | |
Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
Needle puller * | Sutter Instruments | P-87 | |
Stereomicroscope for microinjection * | Nikon | SMZ1500 | We also use Wild 5M and Olympus SZ61 with transmitted light stand |
Picoinjector * | Harvard Instruments | Pli-90 | We also use Pli-100 |
Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Zeiss | Zeiss AxioImager | 5X Fluar objective has sufficient working distance |
Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Nikon | SMZ1500 | |
* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available. |