Detta protokoll beskriver metoden för genfälle insertionsmutationer använder Gal4-VP16 som den primära reporter och GFP / RFP som sekundära reportrar i zebrafisk. Ungefär en av tio högt uttrycker F0 fisk avkastnings genfälla avkomma co-uttrycker GFP och RFP. Screeningen kan lätt skalas för att anpassa sig till storleken på det laboratorium som utför insertionsmutationer skärmen.
Stor kuvertstorlek och extern utveckling av optiskt genomskinliga embryon gör zebrafisk ett exceptionellt ryggradsdjur modellsystem för in vivo-insertionsmutationer med fluorescerande reportrar att märka uttryck av muterade gener. Flera laboratorier har konstruerat och testat förstärkare-och gen-fälla vektorer i zebrafisk, med hjälp av fluorescerande proteiner, Gal4-och lexA-baserade transkriptionsaktivatorer som reportrar 1-7. Dessa vektorer hade två potentiella nackdelar: suboptimal stringens (t.ex. brist på förmåga att skilja mellan förstärkare-och gen-fälla händelser) och låg mutagenicitet (t.ex. integreringar i gener sällan producerade null alleler). Gene Breaking Transposon (GBTs) har utvecklats för att ta itu med dessa nackdelar 8-10. Vi har ändrat en av de första GBT vektor, GBT-R15, för användning med Gal4-VP16 som den primära genen fälla reporter och lagt UAS: EGFP som sekundär reporter för direkt detektion av genen fälla händelser. ETTILLÄMPNING av Gal4-VP16 som den primära genen fällan reporter ger två stora fördelar. För det första ökar det känslighet för gener som uttrycks vid låga expressionsnivåer. För det andra, gör det möjligt för forskare att använda genfälla linjer som Gal4 drivrutiner till direkt uttryck för andra transgener i mycket specifika vävnader. Detta är särskilt viktigt för gener med icke väsentliga eller överflödiga funktioner, där genen fälla integration inte kan leda till uppenbara fenotyper. Nackdelen med att använda Gal4-VP16 som den primära genen fälla reporter är att gener som kodar för proteiner med N-terminala signalsekvenser är inte mottagliga för fångstmetoder, eftersom de resulterande Gal4-VP16 fusionsproteiner är osannolikt att kunna komma in i cellkärnan och aktivera transkription. Viktigt är att använda Gal4-VP16 inte före välja för nukleära proteiner: vi återhämtat genfälla mutationer i gener som kodar för proteiner som fungerar i kärnan, cytoplasman och plasmamembranet.
Insertionsmutationer har visat sig vara en kraftfull metod för att dissekera geners funktion i olika modellsystem från encelliga organismer som bakterier och jäst till flercelliga organismer som möss och växter. Varje exogena DNA (virus, transposon eller plasmid) kan fungera som en mutagen genom att avbryta väsentliga delar av gener såsom exoner eller promotorer. Den effektiva mål på sådana enkla metoder är ytterst liten i stora komplexa genom, eftersom exoner omfattar endast 1-3% av en typisk ryggradsdjur genomet. Liten effektiv måltavla storlek kan övervinnas genom mycket hög vektorintegrationskurserna, som exemplifieras av den enorma framgången för retroviral insertionsmutationer i zebrafisk 11,12. Däremot introner innefatta ca 20-30% av ryggradsdjur genom. I zebrafisk, transposon-baserade insertionsmutationer vektorer som effektivt införa noll-eller svåra hypomorphic mutationer vid integrering i introner har fått namnet "gen bryta transposons "(GBTs) 8-10. För effektiv integration genfälla, de använder en minimal Tol2 transposon 13,14. Mutagenicitet av GBTs förlitar sig på fisk-härledda splitsningsacceptor och transkriptionstermine / polyadenylationssekvenser. Elementen är ansvariga för GBT mutagenicitet flankeras genom direkta loxP platser för excision av Cre rekombinas. Således injektion av Cre-mRNA leder till effektiv återgång av GBT-inducerade mutationer, även om vissa transposonmutanter sekvenser kvar på integrations locus 9,10.
Den nyligen publicerade GBT vektorer använder mRFP som genen fälla reporter 9,10, vilket leder till två potentiella brister. För det första är det inte känt vilken fraktion av zebrafisk gener uttrycks på en tillräckligt hög nivå för att detekteras genom direkta fluorescerande reporterfusionsproteiner. För det andra är endast en liten undergrupp av gener som förväntas ha viktiga funktioner. Det har beräknats att det bara 1,400-2,400 gener som krävs för zebrafisk development 15,16. De flesta gen fälla mutanter förväntas inte visa uppenbara fenotyper och därför kommer att ha begränsad användbarhet. För att övervinna dessa två begränsningar har vi modifierat GBT-R15 9,10 att använda med Gal4-VP16 som primär genfälla reporter (Balciuniene et al. Under utarbetande). Som med augusti lösa mRFP i GBT-R15 var translationsstartstället avlägsnades från Gal4-VP16. För direkt påvisande av genfälla händelser, våra vektorer innehåller en EGFP reporter under kontroll av 14x Gal4 UAS 17,18.
Flera ytterligare funktioner är konstruerade i vår tvådelad genfällevektor. De UAS: EGFP kassetten flankeras av direkta FRT platser (grå sparrar i figur 1). Injektion av Flp-rekombinas-mRNA leder till excision av UAS: EGFP kassett, lämnar genfälle mutationen omärkt av EGFP fluorescens. Den kan sedan användas i transgena linjer som markerar specifika vävnader eller utvecklingsmässiga händelser genom GFP-fluorescens. Liksom i andraGBTs är hela genen fällan kassett flankerad av direkta loxP platser (öppna femhörningar i figur 1). Detta gör gen fälla händelser reversibel genom uttryck av Cre rekombinas, lätt upprättandet bevis på orsaksförhållande mellan en specifik integration genfälla och observerade fenotyp (Figur 2). Slutligen genfälla kassetten flankerad av inverterade I-SCEI meganuclease ställen (svarta trianglar i fig. 1). I Drosophila, är transposonmutanter integrationer ofta konverteras till borttagningar (brister) genom oprecis excision av P-elementet. Det finns inga bevis för att excision av Tol2 transposon (eller någon annan transposon aktiv i ryggradsdjur som Törnrosa, piggyBac eller Ac / Ds) kan leda till strykningar. Vi ingår därför I-SCEI platser som en potentiell surrogat metod för induktion av strykningar, även om det inte finns några bevis för att jag-SCEI kan inducera deletioner i zebrafisk. Det bör noteras att medan jag-SCEI meganukleas kan användas för att underlätta transgenes i zebrafisk, är DNA-klyvning genom I-SCEI meganuclease används för att studera DNA-reparationsmekanismer, inklusive felbenägen icke-homologa slut att gå, i jäst och däggdjursceller 19-22.
Integration av vår genfällevektor kan leda till EGFP uttryck genom två olika mekanismer. Den första är en sann genfälla händelse (Figur 1C): vektorn integreras i en gen (IMG för insättnings muterade genen), en fusion avskrift mellan 5 'av den endogena IMG avskriften och Gal4-VP16 görs och översätts till en fusionsprotein innehållande den N-terminalen av det protein som kodas av IMG och Gal4-VP16. Detta fusionsprotein binder till 14x UAS och aktiverar transkription av EGFP. I den andra, mindre önskvärda händelsen är en enhancer-fälla (figur 1D): den minimala promotorn framför EGFP faller under kontroll av en förstärkarsekvens i närheten av integrationsstället, vilket leder till produktion av EGFP i absinne för Gal4-VP16 produktion. I vår uppskattning, 30-50% av EGFP uttryck händelser beror på en förstärkare fälla och 50-70% beror på en gen fälla 23 (Balciuniene et al. Under utarbetande). För att skilja mellan dessa två klasser av händelser, har vi gjort en 14xUAS: mRFP transgen linje (Figur 1B), för enkelhetens skull markeras av lins specifika γCry: (. Balciuniene m.fl. i förberedelse) GFP. Gene trap händelser verifieras genom samtidig uttryck av GFP och RFP (jämför C och D i figur 2).
I vår pilot skärm, återhämtade vi över 40 gen fälla händelser efter screening 270 F0 fisk injicerad med en blandning av transposon-DNA och transposas mRNA. Två av våra genfälla integrationer har inträffat i gener med tidigare publicerade kemiskt inducerade mutanter: nsf och FLR. De fenotyper av vår insättnings mutanter nsf tpl6 och flr tpl24 är ytligt omöjlig att skilja från den fenotyps av motsvarande kemiskt inducerade mutanter. Vi noterade också att genfälla händelser visas förspänd mot intron nära 5'-änden av gener, vilket ökar sannolikheten för null-alleler. Vi observerar en viss grad av UAS att tysta (färgskiftning) i alla våra gen fälla linjer, och vissa loci är klart känsligare för omväxlings än andra. Vi tror inte att UAS ljuddämpning är ett betydande problem för förökning av genen fälla linjer, som vi har kunnat för att enkelt propagera alla våra gen fälla linjer genom minst fem generationer genom att välja för GFP uttryck ensam.
Den gen fälla vektorer och metod som beskrivs här används redan i flera oberoende laboratorier. Enligt vår erfarenhet finns det två viktiga steg i processen. Den första kritiska steget är att uppnå en hög frekvens av genen fälla integration i injicerade F0 embryon. Underlåtenhet i detta steg kan ofta hänföras till RNas förorening av injektions reagenser, speciellt miniprep DNA. Det är också mycket viktigt att injicera embryon vid en cellstadiet för geninfångningsexperiment. Enligt vår erfarenhet är Tol2-medierad genmodifiering mycket effektiv, vilket gör det möjligt att få fram transgena linjerna även vid injektion senast den 1 cellstadiet eller med lägre kvalitet DNA. Undermåliga injektioner är mycket mer problematisk när den utför genfälla mutagenes, eftersom endast en liten fraktion av vektor integrationer resultera i effektiva genfälla händelser. Det andra viktiga steget är att ta reda på genfälla händelser genom att korsa vår UAS: mRFP linje. Avsaknad av mRFP uttryck ärnästan alltid ett tecken på en förstärkare fälla händelse. Men ibland bristen på mRFP uttryck kan tyda tysta av de 14x UAS. Därför är det viktigt att behålla de UAS: mRFP linje i ett icke ljuddämpande tillstånd genom att sprida nästa generation med hjälp av individer med hög RFP uttryck när korsas till nsf tpl6.
Vi kan förutse att göra flera förbättringar till våra genfälla vektorer och protokoll. Den första är att använda en mindre repetitiv UAS i genen fällan konstruktionen. Det har visats att en 5x UAS är tillräcklig för att uppnå full aktivering i cellkulturexperiment och att mindre repetitiva UAS-sekvenser är mindre känsliga för metylering och ljuddämpnings 6,25. Det kan också vara möjligt att utforma genfälla vektorer för helt undermutagenes, i analogi med vektorerna som används av den internationella musen genfälle konsortium och nyligen anpassade för zebrafisk 2,26,27. En annan förbättring skulle vara att använda en annan transposon system, exempelvis Sleeping Beauty 28, för att alstra en UAS: mRFP reporter linje. Detta skulle möjliggöra injektion av Tol2-baserade gen fällor direkt till reportern linjen och screening av F0s genom incrossing. Dessutom skulle detta eliminera användningen av två olika genetisk bakgrund, vilket gör tolkningen av förlorad funktion fenotyper mer okomplicerat. Även med dessa förbättringar, skulle den allmänna Gal4 genfälle protokoll presenteras här fortfarande vara fullt tillämpliga.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr Jennifer Emtage för kritisk läsning av manuskriptet, Ryan Gill för tekniskt stöd och hjälp med zebrafisk omsorg och Dr Stephen C. Ekker (Mayo Clinic, Rochster, Minnesota) för reagenser. Vårt arbete har stötts av Temple University College of Science and Technology och National Institutes of Health (R01-HD061749).
Name of the Reagent/Material | Company | Catalog # | Comments |
Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Optional PB wash step is a must |
XbaI restriction enzyme | ThermoFisher | ER0681 | |
mMessage Machine T3 | Ambion | AM1348 | |
RiboLock RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
RNeasy MinElute | Qiagen | 74204 | Can be replaced by phenol extraction and precipitation. Do not use LiCl! |
Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | Has to be non-DEPC treated |
Borosilicate glass capiliaries for microinjection needles | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Microcapiliaries for calibration | Drummond Scientific | 1-000-0010 | |
Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
Needle puller * | Sutter Instruments | P-87 | |
Stereomicroscope for microinjection * | Nikon | SMZ1500 | We also use Wild 5M and Olympus SZ61 with transmitted light stand |
Picoinjector * | Harvard Instruments | Pli-90 | We also use Pli-100 |
Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Zeiss | Zeiss AxioImager | 5X Fluar objective has sufficient working distance |
Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Nikon | SMZ1500 | |
* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available. |