Her presenterer vi en histologisk metode for å fange, merking, optisk fjerne og bildebehandling intakt hjernevev grensesnitt rundt kronisk implanterte microdevices i gnager hjernevev. Resultater fra teknikkene omfatter denne metoden er nyttig for å forstå virkningen av ulike penetrerende hjerneskade-implantater på deres omkringliggende vev.
Forskning i design og bruk av hjerne-implanterte microdevices som microelectrode matriser, har som mål å produsere klinisk relevante enheter som grensesnitt kronisk med omkringliggende hjernevev. Vev rundt disse implantatene er tenkt til å reagere på tilstedeværelsen av enhetene over tid, som inkluderer dannelsen av et isolerende "glial arr" rundt enhetene. Imidlertid er histologisk analyse av disse vevsforandringer typisk utført etter eksplantasjon enheten, i en prosess som kan forstyrre morfologi av vevet av interesse.
Her viser vi en protokoll der kortikale-implanterte enheter er samlet intakt i omkringliggende gnager hjernevev. Vi beskriver hvordan, når perfused med fiksativ blir hjernene fjernet og skiver på en slik måte at man unngår eksplantere enheter. Vi skissere fluorescerende antistoff merking og optiske clearing metoder nyttige for å produsere en informativ, men tykk vevdelen. Til slutt viser vi montering og avbildning av disse vevsdelene for å undersøke den biologiske grensesnittet rundt hjernen-implanterte enheter.
Feltet av neuroprosthetic forskning som mål å hjelpe personer som lider av ulike funksjonshemninger og lidelser ved å omgå syke eller skadde strukturer i kroppen gjennom CNS grensesnitt enheter 1,2. Hjerne-implanterte microdevices som mikroelektroden arrays (MEAs), kan brukes til å ta opp eller stimulere hjernestrukturer, og dermed tillate etablering av langsiktige grensesnittene mellom elektronikk og CNS vev 3-5. Gjennomtrengende MEAs, enheter som er drevet inn i hjernevevet, hold særlig lovende som toveis grensesnitt grunnet nærhet innen hvilke de presenterer elektrodene til et relativt lite sett med nærliggende nevroner 6.
Men komplekse vev svar resultat fra den langsiktige implantasjon av gjennomtrengende MEAs, ofte resulterer i variable og gradvis nedverdigende elektrofysiologiske signal-til-støy-forhold over dager til måneder, og en økning i elektrisk impedlom elektrodestedene og bakken 7,8. De antatte opphavet til disse endringene inkluderer aktivering av microglia, reaktiv astrocytosis langs microdevices, og et tap eller migrasjon av nerveceller fra vevet rundt til implanterte enheter 9-11. En stor utfordring å forstå disse vevsforandringer rundt kroniske, penetrasjon MEAs er vanskeligheten i å ta histologiske data intakt vev-grensesnitt rundt kronisk implanterte enheter 12. Histologisk analyse av vev med enheten / vev-grensesnitt fortsatt til stede ville forbedre dagens enhet-fjerning histologiske protokoller. Med en uforstyrret enhet igjen i vevet, kan den biologiske virkningen av relativt subtile interaksjoner, for eksempel utnyttelse av biokompatible belegg 13,14 eller den elektriske clearing av elektrodeoverflaten 15,16, bli avbildet og analysert med hensyn til implantatet.
Here vi demonstrere en metode for å samle inn, bearbeide og bilde intakt microdevice grensesnitt for detaljert mikroskopi-analyse av det omkringliggende hjernevev. I denne metoden, blir enheten og omkringliggende hjernevev tatt innenfor en tykk (> 250 um) ved hjelp av en vevsdeler vibratome. For å forbedre histologiske etikett penetrasjon inn i disse tykke skiver, er fluorescerende histokjemiske og immunhistokjemisk etiketter påføres i høye konsentrasjoner i løsninger som inneholder blokkering serum og vaskemiddel for flere dager. En optisk clearingløsning er ansatt for å forbedre mikroskopi bildebehandling dybder, og vevet er montert i to-sidige kamre for påfølgende laserskanning konfokalmikroskopi 17. Å fange opp hele histologiske grensesnittet, er en datastyrt translasjonsforskning scenen brukes under fotografering for å samle z-stack panoramaer langs implantater. I tillegg til avbildning anvendt vev etiketter, samle laser reflektans tilbake fra implantaterog overføring lys gjennom vevet både hjelpe lokalisere enheten grensesnittet i forhold til omgivende vev. Tissue utarbeidet etter dette "Device-Capture Histologi" (DCHist) protokollen gir bildebehandling tilgang til morfologisk bevarte vev / enhet interaksjoner, og dermed forbedrer på tidligere enhet-fjerning histologiske protokoller 18.
"Enhet-Capture Histologi" (DCHist) metoden demonstrert her gjør den nære histologiske undersøkelser av morfologisk bevarte interaksjoner mellom hjernevev og vev implantater. DCHist vev samlingen krever nøye separasjon av skallen takmonterte enhetens komponenter fra komponenter implantert i hjernen. DCHist krever også samling av en tykk histologisk vev skive (> 250 mm). Disse vev seksjoner, en gang merket, ryddet, montert, og avbildes, kan gi ny innsikt i implantering skade eller påfølgende kronisk respons på inneliggende enheter. Bruk av avanserte mikroskopi verktøy, kan grenseflaten mellom vev og enheten avbildes og analysert i høy detalj som vist i fig 3-5.
De presenterte teknikkene i sin nåværende form stole på evnen til å langsomt utgrave bort ventilen laget todelte dental sement og Kwik-Sil ned til et punkt på enheten implantasjon.Utnytte dental sement som kan brennes bort eller på annen måte fjernet, og en klar silisium elastomer hvorigjennom liten saks kan ledes visuelt stor hjelp i vellykket skille implanterte enheten fra dens skull-monterte komponenter. Forsøk på å kutte enheten under skallen og over hjernen for å samle det i situ anbefales ikke, da skallen montert implantat vil bli trukket ut av hjernen et betydelig beløp.
Selv tynnere, mindre implantater, som for eksempel enkelt skaft MEAs fra NeuroNexus Technologies, er mest mottagelig for DCHist er prinsippene ikke begrenset til én enhet shanks eller mikroelektroden matriser. Innsamling og bildebehandling strategier er bredt gjeldende for multi-shank enheter og større implantater som kanyler, med de krav er at de må skilles fra noen skallen mount og samlet i en tykk vev delen. Selv om forfatterne er fokusert på analyse av vevomkringliggende corticale implantater, kunne enheter drevet dypere inn i hjernen også samles og avbildes. Dybden av implantatet innsetting bør ikke påvirke fangst av implantatet i et stykke, forutsatt at enheten ikke avviker vilt fra den kjente vinkelen innsetting.
Begrensninger eksisterer til nyttige anvendelse av DCHist metoden. Hjernevev seksjoner er utfordrende å bilde gjennom hundrevis av mikrometer, spesielt i områder med hvit substans, selv om optiske clearing løsninger kan forbedre bildebehandling dyp i ulike vev 21. For ytterligere å forbedre avbildning dybde, kan to-foton eksitasjon mikroskopi anvendes sammen med den optiske clearing beskrevet.
En annen potensiell begrensning av den beskrevne metoden kan være den spesifikke fluorescerende immunhistokjemi metoder og antistoffer ansatt av forskere. Passiv diffusjon stasjoner vanligvis inkorporering av disse markørene gjennom fast vevog bort antigenbindende områder. Endelige antistoff arbeider konsentrasjoner må bestemmes av forskere på en sak til sak for å maksimere etiketten penetrasjon samtidig unngå høye nivåer av bakgrunnen merking. Antistoff merking bør ikke være variabel mellom skiver som behandles identisk, men forskjellige antistoffer kan variere betydelig i deres evne til å penetrere og tagge antigen, med noen antistoffer lett merking antigener mange hundre mikrometer dype og andre merking antigener bare titalls mikrometer dype. Vi beskriver forbedre denne diffusjon ved å påføre Antistoffet merker på høyere enn typiske konsentrasjoner, for flere dager for påføring, og i en oppløsning som inneholder fortynnet vaskemiddel og blokkerer serum. Periodisk å vippe skiver fremmer også selv merking. Antigen henting trinn og alternative fiksering prosesser (f.eks glutaraldehyd, mikrobølgeovn, etc.) kan være hensiktsmessig for spesifikke antigener. Sekundært antistoff-fluorochrome konjugater kan også variere i resultatene deres merking tykke seksjoner, selv om dette ikke har blitt observert av forfatterne bruker Alexa Fluor etiketter fra Invitrogen. Alternativt kan transgene dyr fag uttrykker fluorescerende proteiner i celletyper av interesse anvendes til å unngå problemer med antistoff etikett penetrasjon, som mange fluorescerende proteiner, slik som eGFP, beholder sin fluorescens etter formaldehyd behandling, og kan være umiddelbart visualisert i vevssnitt.
DCHist er et kraftig sett med teknikker for å fange opp og analysere virkningen av implanterte microdevices på hjernevev. Kopling dette histologiske protokoll med in vivo vurdering av elektrofysiologi kvalitet og elektrode impedans data 22 kunne forbedre vår forståelse av de biologiske kilder fysiologi variasjon og fornedrelse. Feltet av implanterte neural proteser særlig kan ha nytte av den detaljerte DCHist imaging av det intakte enhet / vev grensesnitt for å informere videre utvikling av biologisk nøytrale MEA enheter.
The authors have nothing to disclose.
Alle forsøk ble gjort under tilsyn av Purdue Animal Care og bruk komité og Laboratory Animal Program ved Purdue University.
Dette arbeidet ble sponset av Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Microsystems Technology Office (MTO), i regi av Dr. Jack W. Judy (jack.judy @ darpa.mil) som en del av Pålitelig Neural Technology Program, gjennom Space and Naval Warfare Systems Command (SPAWAR) Systems Center (SSC) Pacific Grant No N66001-11-1-4013.
Forfatterne ønsker å takke Mikhail Slipchenko, Don Ready, Greg Richter, Aaron Taylor og Kevin Eliceiri for å dele sine mikroskopi kompetanse.
Reagents | |||
Hoechst 33342 | Invitrogen | 14533 | DNA marker |
Rabbit anti-Iba1 | Wako (Japan) | 019-19741 | Monocyte antibody |
Dental acrylic | Lang Dental (various distributors) | Jet Denture Repair Powder & Liquid | Headcap construction |
Kwik-Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Covering exposed cranial implants |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Tissue processing |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Tissue processing |
Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | Clearing solution |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G20225 | Clearing solution |
Equipment | |||
Curved micro-scissors | World Precision Instruments | 14208 | Cutting implant before removing brain |
Razor blades | Ted Pella | (various sizes) | For use with Brain Block |
Acrylic Brain Matrice | Ted Pella | 15054 | Brain Block to create initial plane in tissue |
Plastic slides | Ted Pella | 260225 | Mounting tissue |
Cover glass | Ted Pella | (various sizes) | Mounting tissue |
Electrode arrays | NeuroNexus Technologies | (various designs) | Example MEAs |
Vibratome | Leica | VT1000 S | Specific system used in presented method |
Vibratome blades | (various suppliers) | Collecting slices | |
24-well plates | (various suppliers) | Storing and processing tissue slices | |
Confocal microscope with motorized XY-scanning stage | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss LSM 710 and ‘Zen 2010’ software | Specific system used in presented method |
Soldering iron | (various suppliers) | Excavating headcap |