Hvordan nevrale nettverk er etablert i den embryonale hjernen er et grunnleggende spørsmål i utviklingspsykologi nevrobiologi. Her har vi kombinert en electroporation teknikken med romanen genetiske verktøy, for eksempel Cre / Lox-plasmider og PiggyBac-mediert DNA transposition system i luftfarten hindbrain å merke rygg interneurons og spore sine aksonale anslag og synaptiske mål på ulike utviklingsstadier.
Electroporation av chick embryonale nevralrøret har mange fordeler som å være rask og effektiv for uttrykket av fremmede gener inn i nerveceller. I dette manuskriptet gir vi en metode som demonstrerer unikt hvordan du electroporate DNA inn i aviær hindbrain på E2.75 for å spesifikt merke en undergruppe av nevrale stamceller, og hvordan å følge sine aksonale anslag og synaptiske mål på mye avanserte stadier av utvikling, opp til E14.5. Vi har utnyttet nye genetiske verktøy, inkludert spesifikke enhancer elementer, Cre / Lox – baserte plasmider og PiggyBac-mediert DNA transposition system for å drive GFP uttrykk i en undertype av hindbrain celler (dorsal mest undergruppe av interneurons, da1). Aksonale baner og mål av da1 axoner følges ved tidlige og sene embryonale stadier på ulike hjernestammen regioner. Denne strategien bidrar avanserte teknikker for målretting celler av interesse i den embryonale hindbrain og for traprosjektfinansiering krets formasjon på flere stadier av utviklingen.
Hindbrain representerer en viktig stafett hub av nervesystemet ved å kommunisere mellom de sentrale og perifere nervesystemet via stigende og synkende nevrale nettverk. Den regulerer grunnleggende funksjoner inkludert respirasjon, bevissthet, hørsel og motorisk koordinasjon 1-3. Under tidlig embryonal utvikling, er virveldyr hindbrain forbigående delt langs anterior-posterior (AP)-aksen i repeterende rhombomeres, der forskjellige nevrale celletyper er dannet og generere flere hjernestammen atomkjerner sentre fire. Hindbrain er også delt langs dorsal-ventral (DV)-aksen i en basal og Alar plate, hvor diskrete nevrale stamceller blir spesifisert og differensiere i forskjellige DV steder 3,5,6. Hvor tidlig AP og DV-spesifikke nevrale mønstre er styrende etablering av funksjonelle hjernestammen circuitries er i stor grad ukjent.
Å få kunnskap om dette grunnleggendespørsmål, er verktøy som kreves for å merke spesifikke undergrupper av nevroner i tidlig hindbrain og for å oppspore sine aksonale baner og tilkoblingsmuligheter på mer avanserte stadier. Vi har tidligere benyttet spesifikke enhancer elementer, og en Cre / LoxP-baserte betinget uttrykk system for sporing aksonal banen dorsal spinal interneurons tidlig chick embryo 7-9. I dagens manuskriptet har vi målrettet hindbrain og oppgradert den eksperimentelle paradigmet for merking sene embryonale hindbrain interneurons, aksoner og deres synaptiske mål, ved hjelp av en modifisert electroporation strategi og PiggyBac – mediert DNA innarbeiding. Vår nye strategi tillater merking av forskjellige nevrale subtyper i den ene siden av hindbrain og sporing av sine aksonale anslag og synaptiske områder på ulike embryonale stadier, fra 2 opp til 12 dager etter electroporation. Basert på denne metoden, merket vi dorsal-mest undergruppe av hindbrain interneurons (dA1/Atoh1 + </sopp> celler) og avdekket to kontralaterale stigende aksonale projeksjon mønstre, kommer hver fra en annen AP plassering og elongates i en distinkt funiculus. DA1 axoner ble funnet i prosjektet og danner synapser i det auditive kjerner, midthjernen og i flere lag av lillehjernen 10.
Kombinasjonen av chick elektroporering, genetisk sporing av nevroner og analyse av projeksjon nettsteder på mye avanserte stadier av utvikling gir en unik plattform for å studere dannelsen av nevrale nettverk i hjernen og å belyse molekylære mekanismer som styrer kretsen formasjon.
I ovo electroporation er et mulig, pålitelig og effektivt verktøy for å undersøke celle spesifikasjon og aksonal veiledning under chick nervesystemet utvikling 20. I denne protokollen beskriver vi en modus for elektroporering i chick hindbrain på E2.75 hjelp enhancer elementer som gjør den betingede merking av bestemte interneurons. Denne strategien er kombinert med PiggyBac-mediert innarbeiding system for å sette inn fremmede gener inn i chick genomet, som muliggjør sporing av aksonale ruter…
The authors have nothing to disclose.
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number |
L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes | BTX, Harvard Apparatus | 45-0162 |
pulse generator, ECM 830 | BTX, Harvard Apparatus | 45-0002 |
OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 O.C.T. Compound |
Nail Polish | From Any Commercial Supplier |