構造研究のためのジスルフィド安定化膜貫通ペプチド複合体の生産
Summary
膜に埋め込まれたタンパク質ドメイン間の相互作用の生物物理学的および生化学的研究は多くの技術的課題は、適切な教材を入手されているの最初に直面しています。この記事では、ソリューションの核磁気共鳴（NMR）およびその他の分析アプリケーションによる構造解析に適しているジスルフィド安定化膜貫通ペプチド複合体を製造し、精製するためのプロトコルについて説明します。
Abstract
膜タンパク質の脂質埋αヘリックスドメイン間の物理的相互作用は、膜タンパク質複合体のフォールディングおよびアセンブリに、このような膜貫通（TM）シグナリングと細胞表面のタンパク質レベルの規制などの動的過程において重要な役割を果たしています。特定の配列の関連付けを駆動する構造的特徴を理解することは、TMのペプチド複合体の洗練された生物物理学的および生化学的解析を必要とします。しかし、TMドメインの極端な疎水性は、標準的なペプチド化学の技術を使用して操作するためにそれらを非常に困難にし、適切な勉強材料の生産は、多くの場合、法外にやりがいを証明している。ペプチドは、安定した螺旋状のコンフォメーションとフォーム複合体を採用することができる条件を特定することは、 自発的に難易度のさらなるレベルを追加します。ここで我々は、 大腸菌で発現される材料からホモまたはヘテロ二量体のTMペプチド複合体を製造するための手順を紹介鞍部私は、このように比較的安価に核磁気共鳴（NMR）やその他のアプリケーション用の非天然アミノ酸のための安定同位体標識の取り込みを可能にします。この方法で重要な技術革新は、TM複合体が生成され、洗剤、脂質又は他の膜模倣材料に再構成したとき、安定した化学量論的で均質な構造を形成することができる共有結合 （ジスルフィド架橋）アセンブリのように精製されていることである。我々はまた、単一のTMドメインまたは架橋錯体を生成するかどうかも同様に適用可能であり、新しいTMシーケンスにこれらのメソッドを適応させるためのアドバイスを提供発現および精製のために慎重に最適化された手順を紹介します。
Introduction
このプロトコルは、細部私達は溶液NMRを用いた構造研究のための膜貫通（TM）ペプチドのジスルフィド安定な錯体を生成するために開発した手順を実行します。手順は、ΔtrpLE1413融合システムによってもたらされる堅牢な表現を利用しています（下記参照）と定義された組成のTMペプチド複合体は、現代の多次元NMR実験のために洗練された安定同位体標識技術を使用して生成することができます。私たちは、リンパ球活性化免疫受容体が（最近1日）は、TMドメイン間の相互作用を介して複数の膜タンパク質サブユニットから組み立てられる方法に関する重要な新情報が明らかになったいくつかのNMR構造を決定するためにこれらの技術を採用してきた。これらの技術は、他の多くの膜タンパク質のシステムだけでなく、溶液NMRに加え下流の分析方法の広い範囲に適用されます。ここに示す例では、ネイティブのシステイン残基を利用している間自然にジスルフィド結合タンパク質を模倣する複合体を作成するために、デザインを使用しても同様に、通常、そのようなホモとのヘテロ二量体TM複合体として弱く、非共有結合性相互作用によって一緒に保持されている複合体を安定化するために設計されたジスルフィド結合を作成するのに最適です上皮成長因子受容体（EGFR）ファミリータンパク質2-4またはヘテロαβインテグリン錯体5,6。
そのようなTMのタンパク質の脂質二重膜貫通部分に由来するもののような非常に疎水性のペプチド配列は、生化学的および生物物理学的研究のために非常に困難な課題である。標準タンパク質およびペプチド化学技術を用いて操作することは非常に困難であることに加えて、彼らはしばしば細胞に非常に有毒であり、したがって、組換え的に生成することは困難である。我々 7,8と他人9-11カルボキシ末端フレームのような細菌で、このような困難なペプチド配列を発現させる重要な成功を収めている大腸菌由来ΔtrpLE1413シーケンスの修正版への融合大腸菌trpオペロン12。この配列によってコードされるポリペプチドtrpLE〜13 kDaのは、T7プロモーターの下で高いレベルで製造することができると完全に毒性および/または不安定性に関連する問題が回避され、封入体に局在する。 trpLE配列からアミノ末端9 -ヒスチジンタグ13と内部メチオニンおよびシステイン残基の除去14許さtrpLE-ペプチド融合体は、金属イオンアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、臭化シアン（CNBrを使用して消化するの添加による配列の改変）は、所望のペプチド配列を解放します。我々は、正常に、最大4つのTMのドメインを（;また、ディスカッションのセクションを参照してください7,8および未発表の結果）が含まれている膜タンパク質の断片を表すtrpLE融合としてダース以上の異なる配列を発現させるためにこのシステムを使用している。
ザこのプロトコルでは鍵の技術革新は、構造化されていないと非常に難溶性trpLE-TMの融合を効率的に合理化されたワークフローのコンテキスト内でジスルフィド架橋することができる条件の同定である。高収量の発現、取扱い及びペプチド生成物の精製のいくつかの側面も徹底的に最適化されており、ここに示した推奨事項は、非ジスルフィド架橋（モノマー）TMペプチド製品の生産のために均等に関連しているされています。
Protocol
Representative Results
Discussion
trpLE-TM融合の発現は我々の経験では、trpLE-TM融合が不十分37℃で豊かな培養培地中で表現され、ここに記載の培養条件は、利回りが及ぶと一から四、TMドメインを含有する多くの異なるシーケンスのために成功した証明した50〜150ミリグラム/純粋、無傷の融合のL。 3つまたは4つのTMのGPCRの断片（それぞれヒトCCR5 TM1〜TM3とTM4-TM7、）またはヒトシグナルペプチドペプチダーゼのコア触媒断…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
とビクトリア州政府（MECへVESKIイノベーションフェローシップ;、この仕事のための資金は、オーストラリアの国立保健医療研究評議会（独立研究機関インフラ支援スキーム[IRIISS]助成WEHIへNHMRCプロジェクト無償1011352 MECおよびMJCの）によって提供されWEHIにビクトリア州政府インフラ運用·サポート）。 MECは、オーストラリアの研究評議会のエリザベス女王二世·フェローでもある。 EFXBは、メルボルン大学のノーマヒルダシャスター奨学金プログラムからの支援を認めている。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
Referências
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