Complexos de produção de transmembrana Disulfide-estabilizados Peptídicos para estudos estruturais

Summary

Estudos biofísicos e bioquímicos das interações entre os domínios membrana-proteína embutidos enfrentar muitos desafios técnicos, a primeira das quais é a obtenção de material de estudo adequado. Este artigo descreve um protocolo para a produção e purificação de complexos estabilizados por dissulfureto transmembranares peptídicas que são adequadas para análise estrutural por ressonância solução magnética nuclear (RMN) e de outras aplicações analíticas.

Abstract

Interacções físicas entre os lípidos incorporados alfa-helicoidais domínios de proteínas da membrana desempenham um papel crucial na dobragem e montagem de complexos de proteínas de membrana e em processos dinâmicos, como transmembranar (TM) de sinalização e regulação dos níveis de proteína da superfície celular. Compreender as características estruturais de condução a associação de seqüências particulares requer sofisticadas análises biofísicos e bioquímicos de complexos peptídeo TM. No entanto, a hidrofobicidade extrema de domínios TM torna-os muito difíceis de manipular utilizando técnicas de química de péptidos e a produção de material de estudo adequado muitas vezes se torna proibitivamente desafiador. Identificando as condições sob as quais os péptidos podem adoptar conformações helicoidais estáveis ​​e formam complexos espontaneamente acrescenta outro nível de dificuldade. Apresentamos aqui um processo para a produção de homo-ou hetero-dímeros de complexos de peptídeos de TM a partir de materiais que são expressas em E. coli, o que permite a incorporação de etiquetas de isótopos estáveis ​​para a ressonância magnética nuclear (RMN), ou não naturais, ácidos aminados para outras aplicações de forma relativamente barata. A principal inovação neste método é que os complexos de TM são produzidos e purificados como covalentemente associadas (dissulfureto reticulado) montagens que podem formar estruturas estáveis, estequiométrica e homogéneo, quando reconstituído em lípido detergente, ou outros materiais de membrana-miméticos. Nós também apresentamos procedimentos cuidadosamente otimizados para expressão e purificação que são igualmente aplicáveis ​​se produzir domínios únicos TM ou complexos reticulados e dar conselhos para adaptar estes métodos para novas seqüências TM.

Introduction

Este protocolo detalhes um procedimento que desenvolvemos para produzir complexos estabilizados por dissulfureto de transmembrana (TM) péptidos para estudos estruturais de RMN utilizando solução. O processo tira partido da expressão robusta proporcionada pelo sistema de fusão ΔtrpLE1413 (ver abaixo) e permite que os complexos de peptídeos de TM da composição definida para ser gerados usando técnicas sofisticadas de isótopos estáveis ​​de rotulagem para as modernas experiências de RMN multidimensionais. Nós empregamos essas técnicas para determinar as estruturas de RMN, que revelou várias novas e importantes informações sobre como linfócitos activadores immun....

Protocol

1. Clonagem e Design Construct

Clonar as sequências de interesse no vector PMM-peptídeo (que podem ser fornecidos a pedido), utilizando os locais de restrição HindIII e BamHI (ver Figura 1). O inserto de DNA de cadeia dupla deve incorporar, na seguinte ordem: um sítio HindIII, um único codão de metionina para a clivagem com CNBr, a E. peptídeo coli codões optimizados sequência codificadora, um codão de paragem, um sítio BamHI. Todas as outras metioninas no péptido devem ser eliminados e a sequência de dipeptídeo asp-pro deve ser evitada, uma vez que vai também ser clivado em condições ácidas.

Results

O nível de expressão obtido para fusões trpLE é variável e fortemente dependente da sequência de amino-ácido do péptido ligado. Figura 3 mostra a análise de SDS-PAGE de pré-indução (pista 1) e de tempo de colheita (pista 2) As amostras de uma cultura que produziu aproximadamente 120 mg de puro, fusão trpLE-DAP12TM intacta a partir de 1 litro de cultura e de 4 ml de matriz de níquel. Toda a fusão trpLE-DAP12TM foi localizado para a inserção do corpo de pelotas (pista 4), em oposição ao sobrenadante (pist.......

Discussion

A expressão de fusões trpLE-TM. Na nossa experiência, trpLE-TM fusões são pobremente expressa em meio de cultura rico, a 37 ° C, e as condições de cultura aqui descritas tenham sido bem sucedida para muitas sequências diferentes contendo 1-4 domínios TM com rendimentos variando 50-150 mg / L de fusão pura e intacta. Codificação de fusões de três ou de quatro fragmentos de TM GPCR (CCR5 humano TM1-TM3 e TM4-TM7, respectivamente) ou um fragmento do núcleo catalítico da peptidase sinal peptídeo humano (quatro domí.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente / Material	Companhia	Número de Catálogo	Comentários
Brometo de cianogénio	ALDRICH	P.No-C91492, CAS-506-68-3	Substância perigosa. Mercadorias perigosas. Muito tóxico por inalação, em contacto com a pele e por ingestão. O contato com ácidos liberta gases muito tóxicos. Muito tóxico para os organismos aquáticos, pode causar a longo prazo efeitos negativos no meio ambiente aquático.
Ácido trifluoroacético	SIGMA-ALDRICH	P.CODE-1000984387, número CAS 76-05-1	Substância perigosa. Mercadorias perigosas., Provoca queimaduras graves. Nocivo por inalação. Nocivo para os organismos aquáticos, pode causar a longo prazo efeitos negativos no ambiente aquático.
2-mercaptoetanol	SIGMA-ALDRICH	P.No M7154, número CAS 60-24-2	Substância perigosa. PRODUTOS PERIGOSOS. Tóxico por inalação, em contacto com a pele e por ingestão. Irritante para a pele. Risco de lesões oculares graves. Pode causar sensibilização em contacto com a pele. Muito tóxico para os organismos aquáticos, pode causar a longo prazo efeitos negativos no meio ambiente aquático.
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol	SIGMA-ALDRICH	Número do produto 52512, CAS. 920-66-1	Substância perigosa. PRODUTOS PERIGOSOS. Nocivo por inalação e ingestão. Causa queimaduras.
Ácido fórmico	Merck KGaA	K41186564	Líquido inflamável e vapor. Provoca queimaduras na pele e lesões oculares graves.
Uréia	UNIVAR, AJAX Finechem	Número de Produto, 817, CAS 57-13-6	Quando aquecido, dezembroomposes de dióxido de carbono e amónia; se queimado, emite pequenas quantidades de óxidos de azoto. Pode causar vermelhidão e irritação da pele e dos olhos.
Cloridrato de guanidina	Amresco	P.No-M110, Número CAS: 50-01-1	Nocivo se ingerido, causa irritação ocular grave, provoca irritação da pele, toxicidade oral aguda, irritante da pele Irritante aos olhos.
TRITON X-100	SIGMA	Número-T8532 produto CAS: 9002-93-1	Triton X-100 é um detergente não iónico, 100% do ingrediente activo, que é muitas vezes utilizado em aplicações bioquímicas para solubilizar as proteínas. Triton X-100 não tem propriedades antimicrobianas e considerado como um detergente comparativamente suave não desnaturante
Sua-Select gel níquel-Affinity	SIGMA-ALDRICH	Catálogo Num-P6611	IS-Select Gel de Afinidade O níquel é um produto de metal imobilizado iões de cromatografia de afinidade (IMAC). O Nick HIS-Selectel gel de afinidade é um quelato de propriedade quadridentado em agarose frisado carregada com níquel, que é concebido para ligar especificamente proteínas contendo histidina.
(-)-Glutationa, oxidado	SIGMA-ALDRICH	Num catálogo 150568
Misonix sonicador S-3000	QSONICA	S-3000 (descontinuado)	Potência máxima de 600 watts. Ponta da sonda substituível 1,2 cm leva 1,2 cm de alta intensidade, alto volume de dicas e uma gama de alta intensidade, baixo volume dicas. Mais próximos modelos atualmente disponíveis nesta empresa são Q500 e Q700.
RP-HPLC: BioLogic sistema de cromatografia DuoFlow, versão de software 5.3	Bio-Rad Laboratories	Num catálogo 760-0047, Config Não: AU500571, No de série: 484BR3705	Liga-se a péptidos de colunas de fase reversa de HPLC em alta aqfase móvel ueous e são eluídos de colunas de RP HPLC com fase orgânica elevada móvel. Em RP HPLC péptidos são separados com base no seu carácter hidrófobo. Os péptidos podem ser separados através da execução de um gradiente linear de solvente orgânico.
Prep HT C3 ZORBAX 300SB-coluna analítica de HPLC, de 21,2 x 150 mm, tamanho de partícula 5 | iM	Agilent	Não Produto: 895150-909	HPLC em fase reversa colum
NuPAGE 12% Bis-Tris Gels	Life Technologies	NP0341BOX	Pré géis elenco para eletroforese de proteínas
Slide-A-Lyzer G2 Cassetes diálise, 3.5K MWCO	Thermo Scientific	Nenhum produto: 87724	Amostra de diálise